(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111617261 A(43)申请公布日 2020.09.04
(21)申请号 202010438614.3(22)申请日 2020.05.22
(71)申请人 乾元康安（苏州）生物科技有限公司
地址 215400 江苏省苏州市太仓市沙溪镇
昭衍路1号13幢01室(72)发明人 盛剑鹏
(74)专利代理机构 苏州市方略专利代理事务所
(普通合伙) 32267
代理人 石磊(51)Int.Cl.
A61K 47/68(2017.01)A61K 45/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 37/06(2006.01)A61P 31/18(2006.01)
(54)发明名称
靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用
(57)摘要
本发明公开了一种靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用方法，通过将CD45抗体和药物偶联，通过靶向CD45用于高度选择性的清除正常、病变、癌变的免疫细胞，本发明所述的靶向CD45抗体药物偶联物可用于清除病变或癌变免疫细胞，代替化疗药物，治疗血液系统疾病。本发明所述的靶向CD45抗体药物偶联物只针对免疫细胞，不会杀伤其他活跃分裂细胞，靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(GVHD)，因此可同时移植大量的赠体成熟免疫细胞，快速建立免疫系统。CN 111617261 A
A61P 7/00(2006.01)
权利要求书2页 说明书10页序列表33页 附图12页
CN 111617261 A
权 利 要 求 书
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1.靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，由靶向部分与药物部分组成；所述靶向部分由单抗或多抗构成，靶向CD45；所述药物部分包括但不限于小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素中的一种或者多种。
2.根据权利要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述小分子药物包括Maytansine、Dolastatin、Cemadotin Tasidotin、Cryptophycin、Eribulin meslyat、(+)-CC-1065、Adozelesin、Carzelesin、Bizelesin、KW-2189、SJG-136、vedotin、emtansine、ozogamicin、auristatins, taxol derivatives中的一种或者多种；所述大分子毒素包括白喉毒素、假单胞菌外毒素、绿脓杆菌毒素、绿脓杆菌外毒素、菌外毒素中的一种或者多种；所述生物活性肽包括GLP-1；所述细胞裂解免疫活性蛋白包括Fas ligands。
3.根据权要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述靶向部分为CD45单抗，所述药物部分为白喉毒素，所述CD45单抗与所述白喉毒素通过包含Furin蛋白剪切酶识别位点序列的氨基酸片段连接。
4.根据权利要求1所述的靶向CD45的抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物为CD45 Ab-DTA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。
5.包括如权利要求1-4任一项所述的靶向CD45的抗体药物偶联物的药物组合物。6.表达如权利要求1-4任一项所述的靶向CD45的抗体药物偶联物的生产载体，其特征在于，所述生产载体包括编码以下部分氨基酸的核酸序列：靶向CD45抗体轻链、靶向CD45抗体重链、白喉毒素、白喉毒素与重链之间由Furin蛋白剪切酶识别位点的氨基酸以及6 X His。
7.表达如权利要求4所述的CD45 Ab-DTA重组蛋白的生产载体，其特征在于，所述生产载体为pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His，其序列为SEQ ID NO. 2。
8.构建如权利要求7所述的表达CD45 Ab-DTA重组蛋白的生产载体的方法，包括以下步骤：
(1)以pTrioz空白质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段IgHC；
(2) 以pIRES-proHB EGF WT质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.9所示的基因片段DTA；
(3) 以步骤2和3得到的基因片段IgHC与DTA为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物进行Overlap PCR得到序列如SEQ ID NO.10所示的融合基因片段IgHC-Furin-DTA-6Xhis；
(4) 将目的基因片段IgHC-Furin-DTA-6XHis利用酶切位点NheI、AvrII克隆至载体pTrioz，得到载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His，如 SEQ ID NO.1所示；
(5) 合成如SEQ ID NO.11所示序列CD45 Ab轻链；以合成产物为模板，利用序列如SEQ ID NO.12所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.13所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.14所示的基因片段CD45 Ab L；将PCR产物利用酶切位点NcoI、BsiWI克隆至载体ppTrioz-Furin-DTA-6 X His，得到载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His,如 SEQ ID NO.15所示；
(6) 合成如SEQ ID NO.16所示序列CD45 Ab重链；以合成产物为模板，利用序列如SEQ
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ID NO.17所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.19所示的基因片段CD45 Ab H；将PCR产物利用酶切位点NheI、EcoRV克隆至载体ppTrioz-L-Furin-DTA-6 X His，得到生产载体pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His,如 SEQ ID NO. 2所示。
9.利用如权利要求8所述的表达CD45 Ab-DTA重组蛋白的生产载体来生产CD45 Ab-DTA重组蛋白的方法，包括以下步骤
(1) 培养TR 细胞；
(2) 取权利要求8中获得pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His生产载体转染至TR 细胞；
(3) 培养转染后的TR 细胞并收取CD45 Ab DTA重组蛋白。
10.如权利要求1-4任一项所述的靶向CD45的抗体药物偶联物在制备用于清除正常、病变、癌变的免疫细胞方面的药物、制备治疗血液系统疾病方面的药物、制备辅助自体、异体骨髓移植方面的药物、制备治疗免疫系统疾病方面的药物中的应用；所述免疫系统疾病包括但不限于艾滋病。
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说 明 书
靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用
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技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及靶向CD45抗体药物偶联物的构建与应用。技术背景
[0002]血液病包括原发于血液系统的疾病和继发于其他疾病所致血液系统异常的疾病，在医学上血液病也是一种很“庞大”的疾病，它的病种很多，分类很广，主要分为四个大类：造血干细胞疾病、红细胞疾病、粒细胞疾病与出血性疾病,其中前三者可以通过骨髓移植来治疗。
[0003]骨髓移植分为两类：一类为异基因骨髓移植，一类为自体骨髓移植。异基因与自体骨髓移植各有优缺点。自体骨髓移植的最大缺点为复发率高，原因是自体骨髓中的基因缺陷并未得到修复。异基因骨髓移植需有与患者人类白细胞抗原(HLA)相匹配的父母、子女、同胞以及极少数的无亲缘关系的供髓者所输入的异体骨髓。异基因骨髓移植受到诸多因素及时间影响，其成败的关键之一是HLA(人类白细胞抗原)配型问题，如果骨髓供者与患者(受者)的HLA不同，易发生轻重不等的移植物抗宿主病(GVHD)，甚至危及患者的生命。[0004]上述自体和异体骨髓移植方面的缺陷大大影响了血液系统疾病的治愈率。发明内容
[0005]抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)是将单克隆抗体药物的高特异性和细胞毒药的高活性相结合，用以提高药物的靶向性、减少毒副作用。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比，ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素，而不依赖抗体对靶点蛋白功能的阻断功能。而CD45是一种主要表达于免疫细胞表面的信号分子，其广泛表达于T细胞、B细胞、粒细胞等免疫细胞，因此CD45靶向免疫细胞的靶点。[0006]本发明旨在提供一种针对免疫细胞的抗体药物偶联物，通过靶向CD45实现，用于清除正常、病变、癌变的免疫细胞，与自体、异体骨髓移植联用，治疗血液系统疾病、免疫系统疾病，包括但不限于艾滋病。[0007]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：[0008]靶向CD45的抗体药物偶联物，由靶向部分与药物部分组成；所述靶向部分由单抗或多抗构成，靶向CD45；所述药物部分包括但不限于小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素中的一种或者多种。[0009]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述小分子药物包括Maytansine、Dolastatin、Cemadotin Tasidotin、Cryptophycin、Eribulin meslyat、(+)-CC-1065、Adozelesin、Carzelesin、Bizelesin、KW-2189、SJG-136、vedotin、emtansine、ozogamicin、auristatins,taxol derivatives中的一种或者多种；所述大分子毒素包括白喉毒素、假单胞菌外毒素、绿脓杆菌毒素、绿脓杆菌外毒素、菌外毒素中的一种或者多种；所述生物活性肽包括GLP-1；所述细胞裂解免疫活性蛋白包括Fas ligands。[0010]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述靶向部分为CD45单抗，所述药物
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说 明 书
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部分为白喉毒素，所述CD45单抗与所述白喉毒素通过包含Furin蛋白剪切酶识别位点序列的氨基酸片段连接。[0011]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述抗体药物偶联物为CD45 Ab-DTA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。[0012]进一步的，包括上述靶向CD45的抗体药物偶联物的药物组合物。[0013]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述生产载体包括编码以下部分氨基酸的核酸序列：靶向CD45抗体轻链、靶向CD45抗体重链、白喉毒素、白喉毒素与重链之间由Furin蛋白剪切酶识别位点的氨基酸以及6 X His。[0014]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物，所述生产载体为pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His，其序列为SEQ ID NO.2。[0015]进一步的，上述生产载体为pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His的构建方法，包括以下步骤:[0016](1)以pTrioz空白质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段IgHC；[0017](2)以pIRES-proHB EGF WT质粒为模板，利用序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.9所示的基因片段DTA；[0018](3)以步骤2和3得到的基因片段IgHC与DTA为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物进行Overlap PCR得到序列如SEQ ID NO.10所示的融合基因片段IgHC-Furin-DTA-6Xhis；[0019](4)将目的基因片段IgHC-Furin-DTA-6XHis利用酶切位点NheI、AvrII克隆至载体pTrioz，得到载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His，如SEQ ID NO.1所示；[0020](5)合成如SEQ ID NO.11所示序列CD45 Ab轻链；以合成产物为模板，利用序列如SEQ ID NO.12所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.13所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.14所示的基因片段CD45 Ab L；将PCR产物利用酶切位点NcoI、BsiWI克隆至载体ppTrioz-Furin-DTA-6 X His，得到载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His,如SEQ ID NO.15所示。[0021](6)合成如SEQ ID NO.16所示序列CD45 Ab重链；以合成产物为模板，利用序列如SEQ ID NO.17所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.18所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.19所示的基因片段CD45 Ab H；将PCR产物利用酶切位点NheI、EcoRV克隆至载体ppTrioz-L-Furin-DTA-6 X His，得到生产载体pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His,如SEQ ID NO.2所示。[0022]进一步的，使用上述生产载体生产CD45 Ab-DTA重组蛋白的方法，包括以下步骤：[0023](1)培养TR细胞(所述TR细胞的构建见实施例8)；[0024](2)取pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His生产载体转染至TR细胞；[0025](3)培养转染后的TR细胞并收取CD45 Ab DTA重组蛋白[0026]进一步的，上述CD45 Ab DTA重组蛋白的纯化方法，包括以下步骤:[0027](1)使用Ni-NTA Superflow Resin纯化CD45 Ab DTA；[0028](2)使用NanoDrop测定CD45 Ab DTA重组蛋白浓度，并调整至2mg/Ml。
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进一步的，上述CD45 Ab DTA重组蛋白清楚免疫细胞的测试方法包括如下步骤:
[0030](1)在6周大C57小鼠注射CD45 Ab DTA 200ug，一周三次，持续一周[0031](2)用流式细胞仪检测免疫细胞清除程度[0032]进一步的，上述靶向CD45的抗体药物偶联物在制备用于清除正常、病变、癌变的免疫细胞方面的药物、制备治疗血液系统疾病方面的药物、制备辅助自体、异体骨髓移植方面的药物、制备治疗免疫系统疾病方面的药物中的应用；所述免疫系统疾病包括但不限于艾滋病
[0033]综合上述方案，本发明提供了靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用，至少有以下方面的有益效果：本发明所述的靶向CD45抗体药物偶联物可用于清除病变或癌变免疫细胞，代替化疗药物，治疗血液系统疾病；与传统骨髓移植相比，具有四大优势：[0034](1)无需化疗、放疗即可清除受体原有免疫细胞，副作用低，减轻病人负担；[0035](2)靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(GVHD),无需HLA配对，使得骨髓赠体的范围大大增加[0036](3)治疗白血病或淋巴瘤时，非HLA配对的异基因骨髓移植可起到杀伤癌细胞作用[0037](4)肠道上皮细胞形成的物理屏障被破坏，肠道菌群转移，造成感染；以及赠体骨髓重新建立免疫细胞的空窗期时微生物入侵造成的感染。靶向CD45抗体药物偶联物只针对免疫细胞，不会杀伤其他活跃分裂细胞。靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(GVHD)，因此可同时移植大量的赠体成熟免疫细胞，快速建立免疫系统。从以上两个方面，靶向清除免疫系统避免感染的发生。
附图说明
[0038]图1：如图1所示靶向CD45抗体药物偶联物的结构；[0039]图2：空质粒pTrioz的结构示意图；[0040]图3：空质粒pTrioz-Furin-DTA-6 X His构建流程；[0041]图4：质粒pTrioz-Furin-DTA-6 X His结构示意图[0042]图5：质粒pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His构建流程；[0043]图6：质粒pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His构建流程:[0044]图7：靶向CD45抗体药物偶联物生产质粒pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His的机构示意图；[0045]图8：流式细胞仪检测免疫细胞清除程度；[0046]图9：9a小鼠实验流程示意图，9b:野生型Balb/C小鼠，未做骨髓移植处理；9c:野生型Balb/C小鼠注射CD45 Ab-DTA后；[0047]图10：基因改造载体pX260a-GFP-Dph7的构建流程示意图；[0048]图11：pX260a-GFP空载体的质粒结构示意图；[0049]图12：基因改造载体pX260a-GFP-Dph7的质粒结构示意图；[0050]图13：pMyc-IRES-GFP空质粒示意图；[0051]图14：pMyc-DTA-IRES-GFP示意图；[0052]图15：TR细胞株鉴定结果图；[0053]图16：TR细胞株检测结果图。
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具体实施方式
[0054]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。[0055]实施例1
[0056]构建pTrioz-Furin-DTA-6 X His的生产载体，整体流程如附图3所示。[0057](1)以pTrioz空白质粒为模板，如附图2所示，其包含人IgG1轻链C区、人IgG1重链C区，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物
[0058]IgHC-F-NheI-GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物
[0059]IgHC-R-Furin-TGACAATGAGCTACCTACTGATCGCCTGACACGATTTCCTGCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段IgHC；下划线序列为酶切位点。[0060](2)以pIRES-proHB EGF WT质粒(addgene)为模板，利用序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物
[0061]DTA-F-Furin-GCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTCAGGCGCTGATGATGTTGTTGATTC和序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物DTA-R-6XHis-AvrII-CCTAGGGTGGTGATGATGGTGATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATGCCC进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.9所示的基因片段DTA；下划线序列为酶切位点[0062]PCR反应体系如下：
[0063]
[0064]
PCR扩增条件如下：
[0065]
将目的基因片段IgHC和DTA产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并
利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。[0067]利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物IgHC-F-NheI-GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC和SEQ ID NO.8所示的反向引物DTA-R-6XHis-AvrII-CCTAGGGTGGTGATGATGGTGATGAAGAAATGGTTGCGTTTTATGCCC进行PCR；以IgHC、DTA基因片段为
[0066]
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模板，进行Overlap PCR，合成融合基因片段IgHC-DTA(SEQ ID NO.10)，具体步骤如下：[0068]Overlap PCR反应体系如下：
[0069]
[0070]
Overlap PCR扩增条件为：
[0071]
将目的基因片段IgHC-DTA克隆至空载体pTrizo：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。纯化后的IgHC-DTA和空载体pTrizo分别经MheI、AvrII(NEB)双酶切,空载体pTrizo酶切时加入Alkaline phosphatase(NEB)。PCR酶切产物经AxyPrep PCR Clean-Up Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNA ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示IgHC-DTA插入成功并命名为载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His(SEQ ID NO.1)，如附图4所示，其包含以下部分，人IgG1轻链C区、人IgG1重链C区、Furin识别位点、白喉毒素以及6 X His tag。[0073]实施例2
[0074]商业公司合成如SEQ ID NO.11所示序列CD45 Ab轻链；[0075]以合成产物为模板，利用序列如SEQ ID NO.12CD45 Ab-L-F-NcoI-CCATGGCAATGATGTCCTCTGCTCAG所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.13 CD45 Ab-L-R-BsiWI-CGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGC所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.14所示的基因片段CD45 Ab L；
[0076]将PCR产物利用酶切位点NcoI、BsiWI克隆至载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His，得到中间载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His,如SEQ ID NO.15所示，构建流程如附图5所示。[0077]PCR反应体系如下：
[0072]
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[0079]
PCR扩增条件为：
[0080]
将目的基因片段CD45 L克隆至载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His：PCR产物经琼脂
糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。纯化后的CD45 Ab和载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His分别经NcoI、BsiWI(NEB)双酶切,载体pTrioz-Furin-DTA-6 X His酶切时加入Alkaline phosphatase(NEB)。PCR酶切产物经AxyPrep PCR Clean-Up Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNA ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示CD45 Ab L插入成功并命名为载体pTrioz-CD45 Ab-L-Furin-DTA-6 X His。[0082]实施例3[0083]插入CD45 Ab重链包括如下步骤：[0084]商业公司合成如SEQ ID NO.16所示序列CD45 Ab重链；[0085]以合成产物为模板，利用序列如SEQ ID NO.17 CD45 Ab-H-F-EcoRV所示的正向引物GATATCATGAGCGTGCTGATTCTTTTGTGGC和序列如SEQ ID NO.18 CD45 Ab-H-R-NheI-GCTAGCTACTGGTACTTCGATGTCTG所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.19所示的基因片段CD45 Ab H；[0086]PCR反应体系如下：
[0081]
[0087]
[0088]
PCR扩增条件为：
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[0089]
将目的基因片段CD45 H克隆至载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His：PCR产物经琼
脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。纯化后的CD45 Ab H和载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His分别经EcoRV、NheI(NEB)双酶切,载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His酶切时加入Alkaline phosphatase(NEB)。PCR酶切产物经AxyPrep PCR Clean-Up Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNA ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示CD45 Ab H插入成功,并命名为生产载体pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His(SEQ ID NO.2)，构建流程如附图6所示，载体结构见附图7。[0091]实施例4[0092]CD45 Ab-DTA重组蛋白的生产方法如下：[0093]所使用的毒素耐受细胞株(Toxin resistant,TR)用于生产靶向CD45抗体药物偶联物CD45 Ab-DTA。TR细胞株由本公司开发，TR细胞株具体构建方法见实施例8。[0094](1)将TR细胞用FreeStyleTM293培养基调整至1×106cells/mL，共30mL[0095](2)取载体pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His生产载体37.5微克与0.6mL OptiPROTMSFM培养基混合均匀；[0096](3)取37.5微升FreeStyleTMMAX Reagent反应物与in OptiPROTMSFM0.6mL OptiPROTMSFM培养基混合均匀，静置5分钟；[0097](4)将步骤2与3获得培养基混合均匀，静置30分钟；[0098](5)将步骤4获得1.2mL培养基加入TR细胞中并培养7天，7天后收取CD45Ab-DTA重组蛋白。
[0099]实施例5[0100]CD45 Ab-DTA的纯化方法如下：[0101](1)将30mLNi-NTA Superflow Resin 700g离心2分钟，弃上清；[0102](2)加入60mL平衡液与Ni-NTA Superflow Resin混合均匀，700g离心2分钟，弃上清；[0103](3)将实施例步骤5获得的细胞培养基300g离心5分钟，取上清加入步骤2获得Ni-NTA Superflow Resin中，轻柔混合30分钟后700g离心2分钟，弃上清；[0104](4)使用60mL清洗液与Ni-NTA Superflow Resin混合均匀，700g离心2分钟，弃上清，并清洗3次；[0105](5)使用30mL洗脱液与Ni-NTA Superflow Resin混合均匀，轻柔混合10分钟后
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700g离心2分钟，取上清，上清中包含CD45 Ab-DTA重组蛋白；[0106](6)使用NanoDrop测定CD45 Ab-DTA，并调整至2mg/mL。[0107]实施例6[0108]测试CD45 Ab-DTA对小鼠免疫细胞清除程度方法如下：[0109](1)使用NanoDrop测定CD45 Ab-DTA浓度，并调整至2mg/mL；[0110](2)在6周大C57小鼠注射CD45 Ab DTA 200ug，一周三次，持续一周。[0111](3)用流式细胞仪检测免疫细胞清除程度，结果如附图8所示。[0112]实施例7[0113]CD45 Ab DTA应用于小鼠异体骨髓移植的实施例，流程见附图9a。[0114](1)在6周大Balb/C(CD45.2基因型)中，注射CD45 Ab DTA 200ug每次，一周三次；[0115](2)注射一周后移植同种异体小鼠C57(CD45.1基因型)小鼠的骨髓细胞；[0116](3)四个月后用流式细胞仪检测骨髓移植情况，如图9b所示：野生型Balb/C小鼠，未做骨髓移植处理，其免疫细胞(T细胞、B细胞、粒细胞)均来源于本身，均带有自身免疫标志CD45.2；如图9c所示，野生型Balb/C小鼠注射CD45Ab-DTA后，自身免疫细胞(免疫标志CD45.2)消亡，骨髓移植后，赠体(免疫标志CD45.1)免疫细胞T细胞、B细胞、粒细胞)替代原有骨髓细胞。并实现长期存活。充分说明本发明所述的抗体药物偶联物可以应用于骨髓移植，并效果良好。[0117]实施例8
[0118]毒素耐受细胞株(Toxin resistant,TR)的构建。
[0119]1:构建基因工程改造载体pX260a-GFP-Dph7:整体流程如附图10所示。[0120]设计正向引物Dph7-gRNA-F-TGTTGATGCTTCTCTTTCTCCA(SEQ ID NO.20)，反向引物Dph7-gRNA-R-TCTGAACCAGTGTCCAGCAC(SEQ ID NO.21)，退火结合为Dph7 gRNA(SEQ ID NO.30)。
[0121]Annealing反应体系如下：
[0122]
[0123]
Annealing反应条件如下：
[0124]
将Dph7 gRNA克隆至空载体pX260a-GFP(载体结构如附图11所示)：空载体pX260a-GFP BbsI(NEB)酶切。酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNA ligase(NEB)将载体与Dph7连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示Dph7 gRNA插入成功并命名为基因改造载体pX260a-GPF-Dph 7
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[0125]
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(SEQ ID NO.22)，如附图12所示。
[0126]2:药物毒性耐受生产细胞株(Toxin resistant,TR)的构建方法如下：[0127](1)将FreeStyle 293-F细胞用FreeStyleTM293培养基调整至106cells/mL，共1mL，于6孔板中培养；[0128](2)取实施例1中获得pX260a-GFP-Dph7基因改造载体5微克与125微升P3000TMReagent(thermofisher)混合；
[0129]
(3)取Medium(thermofisher)125微升与3000Reagent
7.5微升混合；
[0130](4)将步骤2与步骤3获得培养基与DNA混合均匀，静置5分钟；[0131](5)将步骤4获得的混合物加入细胞；[0132](6)转染后细胞培养3天；[0133](7)使用FACS Aria III分选GFP阳性细胞至96孔板，每个孔含有一个单细胞；[0134](8)培养3天后，使用胰酶消化，扩增至24孔板；[0135](9)培养3天后，取一半细胞利用dneasy-blood-and-tissue-kit提取DNA，另一半细胞扩增至6孔板。
[0136]随后通过对步骤9提取的DNA检测，验证转化是否成功，包括以下步骤：[0137]利用步骤9得到DNA作为模板，正向引物Dph7-Screen-F-[0138]CTTCCTCACAGACAGAGTCACCCAG(SEQ ID NO.23)，反向引物Dph7-Screen-R-[0139]CGAGAAGGGCCCGAGAGCCTCC(SEQ ID NO.24)作PCR扩增得到Dph7 Screen基因片段(SEQ ID NO.25)。
[0140]PCR反应体系如下：
[0141]
[0142]
PCR扩增条件如下：
[0143]
将目的基因片段Dph7 Screen PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出目的条带
并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收，经Surveyor Enzyme(NEB)酶切。酶切的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后拍照，如附图15所示。[0145]3:检测药物毒性耐受生产细胞株(Toxin resistant,TR)
[0144]
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以pIRES-proHB EGF WT质粒(addgene)为模板，利用正向引物DTA-F-BamHI-
ACCACC
GGATCCATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTC(SEQ ID NO.26)，反向引物DTA-R
(EcoRI)-ACCACCGAATTCTTAGTGGGAATTAGTCATGCCC(SEQ ID NO.27)作PCR扩增DTA基因片段(SEQ ID NO.28)。下划线序列为酶切位点。PCR反应体系同上，PCR扩增条件同上。
[0148]将目的基因片段DTA克隆至空载体pMyc-IRES-GFP(载体结构如附图13所示)：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。纯化后的DTA和空载体pMyc-IRES-GFP分别经EcoRI、BamHI(NEB)双酶切,空载体pMyc-IRES-GFP酶切时加入Alkaline phosphatase(NEB)。PCR酶切产物经AxyPrep PCR Clean-Up Kit(Axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen)回收。利用T4 DNA ligase(NEB)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示DTA插入成功并命名为检测载体pMyc-DTA-IRES-GFP(SEQ ID NO.29)，载体结构如附图14所示。[0149](1)将实施例2中获得的药物毒性耐受生产细胞株用FreeStyleTM293培养基调整至106cells/mL，共1mL，于6孔板中培养；[0150](2)取pMyc-DTA-IRES-GFP检测载体5微克与125微升P3000TMReagent(thermofisher)混合；
[0151][0147]
(3)取Medium(thermofisher)125微升与3000Reagent
7.5微升混合；
[0152](4)将步骤2和3获得的培养基与DNA混合均匀，静置5分钟；[0153](5)将步骤4获得的混合物加入细胞中；[0154](6)转染后细胞培养3天；[0155](7)使用Cyto Flex检测,发现GFP阳性，如附图16所示，即DTA表达，TR细胞株成功表达DTA，表明TR细胞株对毒性耐受。
[0156]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
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SEQUENCE LISTING<110> 乾元康安(苏州)生物科技有限公司<120> 靶向CD45的抗体药物偶联物及其制备和应用<130> 2020<160> 30<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 9195<212> DNA<213> 人工<223> 质粒pTrioz-Furin-DTA-6 X His<400> 1cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 60cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagtc 420agggccccaa cccccccaag cccccatttc acaacacgct ggcgctacag gcgcgtgact 480tccccttgct ttggggcggg gggctgagac tcctatgtgc tccggattgg tcaggcacgg 540ccttcggccc cgcctcctgc caccgcagat tggccgctag gcctccccga gcgccctgcc 600tccgagggcc ggcgcaccat aaaagaagcc gccctagcca cgtcccctcg cagttcggcg 660gtcccgcggg tctgtctcaa gcttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc 720cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccatgccc 780ctggctgcag tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc 840gaggccttgc gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcttgggcg 900ctggggccgc cgcgtgctaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgctaa 960gtctctagcc atttaaaatt tttgataacc agctgcgacg ctttttttct ggcgagatag 1020tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg 1080cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc 1140accgagaatc ggacgggggt agtctcaaac tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc 1200gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg 1260agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg 1320cccgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cttcctcatc 1380cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttgtc 1440gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc 1500ccacactgag tgggtggaga ctgaagagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 1560
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ctgcgtgcac tttgtggcag aggagcagga ctaaatctag aattatccct aatacctgcc 8640accccactct taatcagtgg tggaagaacg gtctcagaac tgtttgtttc aattggccat 8700ttaagtttag tagtaaaaga ctggttaatg ataacaatgc atcgtaaaac cttcagaagg 8760aaaggagaat gttttgtgga ccactttggt tttctttttt gcgtgtggca gttttaagtt 8820attagttttt aaaatcagta ctttttaatg gaaacaactt gaccaaaaat ttgtcacaga 8880attttgagac ccattaaaaa agttaaatga gaaacctgtg tgttcctttg gtcaacaccg 8940agacatttag gtgaaagaca tctaattctg gttttacgaa tctggaaact tcttgaaaat 9000gtaattcttg agttaacact tctgggtgga gaatagggtt gttttccccc cacataattg 9060gaaggggaag gaatatcatt taaagctatg ggagggttgc tttgattaca acactggaga 9120gaaatgcagc atgttgctga ttgcctgtca ctaaaacagg ccaaaaactg agtccttggg 9180ttgcatagaa agctg 9195<210> 2<211> 10018<212> DNA<213> 人工<223> 质粒pTrioz-CD45 Ab-Furin-DTA-6 X His<400> 2cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 60cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagtc 420agggccccaa cccccccaag cccccatttc acaacacgct ggcgctacag gcgcgtgact 480tccccttgct ttggggcggg gggctgagac tcctatgtgc tccggattgg tcaggcacgg 540ccttcggccc cgcctcctgc caccgcagat tggccgctag gcctccccga gcgccctgcc 600tccgagggcc ggcgcaccat aaaagaagcc gccctagcca cgtcccctcg cagttcggcg 660gtcccgcggg tctgtctcaa gcttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc 720cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccatgccc 780ctggctgcag tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc 840gaggccttgc gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcttgggcg 900ctggggccgc cgcgtgctaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgctaa 960gtctctagcc atttaaaatt tttgataacc agctgcgacg ctttttttct ggcgagatag 1020tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg 1080cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc 1140accgagaatc ggacgggggt agtctcaaac tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc 1200gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg 1260agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg 1320
18
CN 111617261 A
序 列 表
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cccgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cttcctcatc 1380cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttgtc 1440gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc 1500ccacactgag tgggtggaga ctgaagagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 1560ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tgcctcattc tcaagcctca gacagtggtt 1620caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaaaactac ccctaaaagc caccggcgag 1680gcgcgccaag tttaaacacc atggcaatga tgtcctctgc tcagttcctt ggtctcctgt 1740tgctctgttt tcaaggtaaa attgactata atgggaattt tgctgttgca cggtgtgata 1800tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca 1860gttgcagtgc aagtcagggc attagcaatt atttaaactg gtatcagcag aaaccagatg 1920gaactgttaa actcctgatc tattacacat caagtttaca ctcaggagtc ccatcaaggt 1980tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctcaccat cagcaacctg gaacctgaag 2040atattgccac ttactattgt cagcagtata gtaagcttcc tccgtggacg ttcggtggag 2100gcaccaagct ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat 2160ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc 2220ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 2280agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc 2340tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc 2400tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttagagggac ctagctggcc 2460agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 2520atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 2580taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 2640ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggaaatgt taattaacta 2700gccatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 2760aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 2820aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2880ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 2940tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 3000ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 3060cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 3120agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 3180gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 3240ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 3300tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 3360tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 3420cacatgttct taattaacct gcaggcgaaa ctcagcttcc ttcgtttccg acttttccat 3480ccgcgtcctc cacttccccg ttccgccctc ccccattgcc aacattctgg ctgagtcacg 3540gcgccccaga gcgcgccagg ctgggggaaa ggagcagaag ggagggccct agcgacccgc 3600gggatgtggt ccgagtcacg tccgaggggg gtggggaggg atcgtgttct cggcgcccgc 3660
19
CN 111617261 A
序 列 表
7/33页
cccttcctag cgcggcctct gggctgcgcc tctcgggggc ggcccgtagc ccagtccgtc 3720gactagttcc gccagagcgc gcgagggcct ccagcggccg cccctccccc acagcagggg 3780cggggtcccg cgctcaccgg aaggagcggg ctcggggcgg gcggcgctga ttggccgggg 3840cgggcctgac gccgacgcgg ctataagaga ccacaagcga cccgcagggc cagacgttct 3900tcgccgaagc ttgccgtcag aacgcaggtg aggggcgggt gtggcttccg cgggccgccg 3960agctggaggt cctgctccga gcgggccggg ccccgctgtc gtcggcgggg attagctgcg 4020agcattcccg cttcgagttg cgggcggcgc gggaggcaga gtgcgaggcc tagcggcaac 4080cccgtagcct cgcctcgtgt ccggcttgag gcctagcgtg gtgtccgcgc cgccgccgcg 4140tgctactccg gccgcactct ggtctttttt ttttttgttg ttgttgccct gctgccttcg 4200attgccgttc agcaataggg gctaacaaag ggagggtgcg gggcttgctc gcccggagcc 4260cggagaggtc atggttgggg aggaatggag ggacaggagt ggcggctggg gcccgcccgc 4320cttcggagca catgtccgac gccacctgga tggggcgagg cctggggttt ttcccgaagc 4380aaccaggctg gggttagcgt gccgaggcca tgtggcccca gcacccggca cgatctggct 4440tggcggcgcc gcgttgccct gcctccctaa ctagggtgag gccatcccgt ccggcaccag 4500ttgcgtgcgt ggaaagatgg ccgctcccgg gccctgttgc aaggagctca aaatggagga 4560cgcggcagcc cggtggagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaagag ggcctggtcc 4620ctcaccggct gctgcttcct gtgaccccgt ggtcctatcg gccgcaatag tcacctcggg 4680cttttgagca cggctagtcg cggcgggggg aggggatgta atggcgttgg agtttgttca 4740catttggtgg gtggagacta gtcaggccag cctggcgctg gaagtcattt ttggaatttg 4800tccccttgag ttttgagcgg agctaattct cgggcttctt agcggttcaa aggtatcttt 4860taaacccttt tttaggtgtt gtgaaaacca ccgctaattc aaagcaaccg gtcgcacgcg 4920tagatatcat gagcgtgctg attcttttgt ggctgttcac agcctttcct ggtgagtgta 4980tcctgtctga tgtgcagctt caggagtcag gacctggcct ggtgaaacct tctcagtcac 5040tttccctcac ctgcactgtc actggctact ccatcaccag tggttatgac tggaactgga 5100tccggcagtt tccaggaaac aaactggagt ggatgggcta cataagctac agtgtagcaa 5160gtactacaac ccatctctca aaagtcgaat ctctatcact cgagacacat ccaagaacca 5220gttctccctg gaatattctg ctactgagga cacagccaca tattactgtg caagaggtag 5280ctactaccgt agtaataaac ggagacggtg accgtggtcc ctgtgcccca gacatcgaag 5340taccagtagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca 5400cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagccggtga 5460cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac 5520agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca 5580cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag 5640ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc 5700tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc 5760ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt 5820tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc 5880agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 5940atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa 6000
20
CN 111617261 A
序 列 表
8/33页
ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc 6060gggacgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca 6120gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc 6180ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 6240gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc 6300actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaagc aggaaatcgt gtcaggcgat 6360cagtaggtag ctcattgtca ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga 6420tggaaaactt ttcttcgtac cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag 6480gtatacaaaa gccaaaatct ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt 6540atagtaccga caataaatac gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct 6600ctggaaaagc tggaggcgtg gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac 6660taaaagtgga taatgccgaa actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt 6720tgatggagca agtcggaacg gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg 6780tagtgctcag ccttcccttc gctgagggga gttctagcgt ttcctatatt aataactggg 6840aacaggcgaa agcgttaagc gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg 6900gccaagatgc gatgtatgag tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat 6960cagtaggtag ctcattgtca tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta 7020agacaaagat agagtctttg aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc 7080ccaataaaac agtatctgag gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg 7140cattagagca tcctgaattg tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg 7200ctggggctaa ctatgcggcg tgggcagtaa acgttgcgca agttatagat ctcgaaacag 7260ctgataattt ggaaaagaca actgctgctc tttcgatact tcctggtatc ggtagcgtaa 7320tgggcattgc agacggtgcc gttcaccaca atacagaaga gatagtggca caatcaatag 7380ctttatcgtc tttaatggtt gctcaagcta ttccattggt aggagagcta gttgatattg 7440gtttcgctgc atataatttt gtagagagta ttatcaattt atttcaagta gttcataatt 7500cgtataatcg tcccgcgtat tctccggggc ataaaacgca accatttctt catcaccatc 7560atcaccaccc taggagcagg tttccccaat gacacaaaac gtgcaacttg aaactccgcc 7620tggtctttcc aggtctagaa gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt 7680tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat 7740tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata 7800ttttactaaa aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct 7860agttcaaacc ttgggaaaat acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca 7920aacagctaat gcacattggc aacagcccct gatgcctatg ccttattcat ccctcagaaa 7980aggattcaag tagaggcttg atttggaggt taaagttttg ccatgctgta ttttagaatt 8040cctgcaggag tcaatgggaa aaacccattg gagccaagta cactgactca atagggactt 8100tccattgggt tttgcccagt acataaggtc aatagggggt gagtcaacag gaaagtccca 8160ttggagccaa gtacattgag tcaataggga ctttccaatg ggttttgccc agtacataag 8220gtcaatggga ggtaagccaa tgggtttttc ccattactga catgtatact gagtcattag 8280ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc aacaggaaag 8340
21
CN 111617261 A
序 列 表
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tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt tgcccagtac 8400aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacat acataaggtc 8460aataggggtg actagtcagt gggcagagcg cacatcgccc ccgagaagtt ggggggaggg 8520gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc 8580gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc 8640gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg 8700gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg 8760agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta 8820agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga 8880ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg 8940ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacaaa cagtagttga 9000caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gactcactat aggagggcca 9060tcatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg 9120tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac gacttcgctg 9180gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg 9240acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg 9300aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc 9360agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg cactttgtgg 9420cagaggagca ggactaaatc tagaattatc cctaatacct gccaccccac tcttaatcag 9480tggtggaaga acggtctcag aactgtttgt ttcaattggc catttaagtt tagtagtaaa 9540agactggtta atgataacaa tgcatcgtaa aaccttcaga aggaaaggag aatgttttgt 9600ggaccacttt ggttttcttt tttgcgtgtg gcagttttaa gttattagtt tttaaaatca 9660gtacttttta atggaaacaa cttgaccaaa aatttgtcac agaattttga gacccattaa 9720aaaagttaaa tgagaaacct gtgtgttcct ttggtcaaca ccgagacatt taggtgaaag 9780acatctaatt ctggttttac gaatctggaa acttcttgaa aatgtaattc ttgagttaac 9840acttctgggt ggagaatagg gttgttttcc ccccacataa ttggaagggg aaggaatatc 9900atttaaagct atgggagggt tgctttgatt acaacactgg agagaaatgc agcatgttgc 9960tgattgcctg tcactaaaac aggccaaaaa ctgagtcctt gggttgcata gaaagctg 10018<210> 3<211> 1127<212> PRT<213> 人工<223> 靶向CD45抗体药物偶联物蛋白序列<400> 3Met Ala Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys1 5 10 15Phe Gln Gly Lys Ile Asp Tyr Asn Gly Asn Phe Ala Val Ala Arg Cys 20 25 30Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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CN 111617261 A
序 列 表
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35 40 45Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 50 55 60Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile65 70 75 80Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 85 90 95Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 100 105 110Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Pro 115 120 125Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 130 135 140Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser145 150 155 160Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 165 170 175Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 180 185 190Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 195 200 205Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 210 215 220Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys225 230 235 240Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Met Ser Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu 245 250 255Phe Thr Ala Phe Pro Gly Glu Cys Ile Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln 260 265 270Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr 275 280 285Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Asn Trp 290 295 300Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser305 310 315 320Tyr Ser Val Ala Ser Thr Thr Thr His Leu Ser Lys Val Glu Ser Leu 325 330 335Ser Leu Glu Thr His Pro Arg Thr Ser Ser Pro Trp Asn Ile Leu Leu 340 345 350
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CN 111617261 A
序 列 表
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Leu Arg Thr Gln Pro His Ile Thr Val Gln Glu Val Ala Thr Thr Val 355 360 365Val Ile Asn Gly Asp Gly Asp Arg Gly Pro Cys Ala Pro Asp Ile Glu 370 375 380Val Pro Val Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro385 390 395 400Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 405 410 415Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 420 425 430Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 435 440 445Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 450 455 460Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys465 470 475 480Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 485 490 495Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 500 505 510Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 515 520 525Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 530 535 540Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys545 550 555 560Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 565 570 575Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 580 585 590Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 595 600 605Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 610 615 620Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys625 630 635 640Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 645 650 655Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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序 列 表
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660 665 670Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 675 680 685Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 690 695 700His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Gly Asn705 710 715 720Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Gly Ala Asp Asp Val 725 730 735Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His 740 745 750Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys 755 760 765Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe 770 775 780Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn785 790 795 800Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr 805 810 815Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr 820 825 830Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln 835 840 845Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg 850 855 860Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Ser Tyr865 870 875 880Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile 885 890 895Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr 900 905 910Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser 915 920 925Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr 930 935 940Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys945 950 955 960Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln 965 970 975
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序 列 表
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Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser 980 985 990Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn 995 1000 1005Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Leu Glu 1010 1015 1020Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu 1025 1030 1035Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His 1040 1045 1050His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser 1055 1060 1065Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 1070 1075 1080Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu 1085 1090 1095Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro 1100 1105 1110Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His His His His His His 1115 1120 1125<210> 4<211> 31<212> DNA<213> 人工<223> 引物IgHC-F-NheI<400> 4gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc c 31<210> 5<211> 65<212> DNA<213> 人工<223> 引物IgHC-R-Furin<400> 5tgacaatgag ctacctactg atcgcctgac acgatttcct gctttacccg gagacaggga 60gaggc 65<210> 6<211> 1032<212> DNA<213> 人工
26
CN 111617261 A
序 列 表
14/33页
<223> 基因片段IgHC<400> 6gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggacgag 720ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt 1020agctcattgt ca 1032<210> 7<211> 65<212> DNA<213> 人工<223> 引物DTA-F-Furin<400> 7gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt agctcattgt caggcgctga tgatgttgtt 60gattc 65<210> 8<211> 48<212> DNA<213> 人工<223> 引物DTA-R-6XHis-AvrII<400> 8cctagggtgg tgatgatggt gatgaagaaa tggttgcgtt ttatgccc 48<210> 9<211> 1212<212> DNA<213> 人工
27
CN 111617261 A
序 列 表
15/33页
<223> 基因片段DTA<400> 9gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt agctcattgt caggcgctga tgatgttgtt 60gattcttcta aatcttttgt gatggaaaac ttttcttcgt accacgggac taaacctggt 120tatgtagatt ccattcaaaa aggtatacaa aagccaaaat ctggtacaca aggaaattat 180gacgatgatt ggaaagggtt ttatagtacc gacaataaat acgacgctgc gggatactct 240gtagataatg aaaacccgct ctctggaaaa gctggaggcg tggtcaaagt gacgtatcca 300ggactgacga aggttctcgc actaaaagtg gataatgccg aaactattaa gaaagagtta 360ggtttaagtc tcactgaacc gttgatggag caagtcggaa cggaagagtt tatcaaaagg 420ttcggtgatg gtgcttcgcg tgtagtgctc agccttccct tcgctgaggg gagttctagc 480gtttcctata ttaataactg ggaacaggcg aaagcgttaa gcgtagaact tgagattaat 540tttgaaaccc gtggaaaacg tggccaagat gcgatgtatg agtatatggc tcaagcctgt 600gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt agctcattgt catgcataaa tcttgattgg 660gatgtcataa gggataaaac taagacaaag atagagtctt tgaaagagca tggccctatc 720aaaaataaaa tgagcgaaag tcccaataaa acagtatctg aggaaaaagc taaacaatac 780ctagaagaat ttcatcaaac ggcattagag catcctgaat tgtcagaact taaaaccgtt 840actgggacca atcctgtatt cgctggggct aactatgcgg cgtgggcagt aaacgttgcg 900caagttatag atctcgaaac agctgataat ttggaaaaga caactgctgc tctttcgata 960cttcctggta tcggtagcgt aatgggcatt gcagacggtg ccgttcacca caatacagaa 1020gagatagtgg cacaatcaat agctttatcg tctttaatgg ttgctcaagc tattccattg 1080gtaggagagc tagttgatat tggtttcgct gcatataatt ttgtagagag tattatcaat 1140ttatttcaag tagttcataa ttcgtataat cgtcccgcgt attctccggg gcataaaacg 1200caaccatttc tt 1212<210> 10<211> 2220<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段IgHC-DTA<400> 10gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagccggt gacggtgtcg 120tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
28
CN 111617261 A
序 列 表
16/33页
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggacgag 720ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt 1020agctcattgt caggcgctga tgatgttgtt gattcttcta aatcttttgt gatggaaaac 1080ttttcttcgt accacgggac taaacctggt tatgtagatt ccattcaaaa aggtatacaa 1140aagccaaaat ctggtacaca aggaaattat gacgatgatt ggaaagggtt ttatagtacc 1200gacaataaat acgacgctgc gggatactct gtagataatg aaaacccgct ctctggaaaa 1260gctggaggcg tggtcaaagt gacgtatcca ggactgacga aggttctcgc actaaaagtg 1320gataatgccg aaactattaa gaaagagtta ggtttaagtc tcactgaacc gttgatggag 1380caagtcggaa cggaagagtt tatcaaaagg ttcggtgatg gtgcttcgcg tgtagtgctc 1440agccttccct tcgctgaggg gagttctagc gtttcctata ttaataactg ggaacaggcg 1500aaagcgttaa gcgtagaact tgagattaat tttgaaaccc gtggaaaacg tggccaagat 1560gcgatgtatg agtatatggc tcaagcctgt gcaggaaatc gtgtcaggcg atcagtaggt 1620agctcattgt catgcataaa tcttgattgg gatgtcataa gggataaaac taagacaaag 1680atagagtctt tgaaagagca tggccctatc aaaaataaaa tgagcgaaag tcccaataaa 1740acagtatctg aggaaaaagc taaacaatac ctagaagaat ttcatcaaac ggcattagag 1800catcctgaat tgtcagaact taaaaccgtt actgggacca atcctgtatt cgctggggct 1860aactatgcgg cgtgggcagt aaacgttgcg caagttatag atctcgaaac agctgataat 1920ttggaaaaga caactgctgc tctttcgata cttcctggta tcggtagcgt aatgggcatt 1980gcagacggtg ccgttcacca caatacagaa gagatagtgg cacaatcaat agctttatcg 2040tctttaatgg ttgctcaagc tattccattg gtaggagagc tagttgatat tggtttcgct 2100gcatataatt ttgtagagag tattatcaat ttatttcaag tagttcataa ttcgtataat 2160cgtcccgcgt attctccggg gcataaaacg caaccatttc ttcatcacca tcatcaccac 2220<210> 11<211> 420<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段CD45 Ab轻链<400> 11atgagcgtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtgagtg tatcctgtct 60gatgtgcagc ttcaggagtc aggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc actttccctc 120acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agtggttatg actggaactg gatccggcag 180tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtgtagc aagtactaca 240acccatctct caaaagtcga atctctatca ctcgagacac atccaagaac cagttctccc 300tggaatattc tgctactgag gacacagcca catattactg tgcaagaggt agctactacc 360
29
CN 111617261 A
序 列 表
17/33页
gtagtaataa acggagacgg tgaccgtggt ccctgtgccc cagacatcga agtaccagta 420<210> 12<211> 26<212> DNA<213> 人工<223> 引物CD45 Ab-L-F-NcoI<400> 12ccatggcaat gatgtcctct gctcag 26<210> 13<211> 26<212> DNA<213> 人工<223> 引物CD45 Ab-L-R-BsiWI<400> 13cgtacgtttg atttccagct tggtgc 26<210> 14<211> 428<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段CD45 Ab L<400> 14ccatggcaat gatgtcctct gctcagttcc ttggtctcct gttgctctgt tttcaaggta 60aaattgacta taatgggaat tttgctgttg cacggtgtga tatccagatg acacagacta 120catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagt gcaagtcagg 180gcattagcaa ttatttaaac tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga 240tctattacac atcaagttta cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg 300ggacagatta ttctctcacc atcagcaacc tggaacctga agatattgcc acttactatt 360gtcagcagta tagtaagctt cctccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca 420aacgtacg 428<210> 15<211> 9608<212> DNA<213> 人工<223> 中间载体pTrioz-L-Furin-DTA-6 X His<400> 15cctgcaggcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 60cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 120tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 180catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 240
30
CN 111617261 A
序 列 表
18/33页
gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 300gctattacca tgatgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 360tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttgactagtc 420agggccccaa cccccccaag cccccatttc acaacacgct ggcgctacag gcgcgtgact 480tccccttgct ttggggcggg gggctgagac tcctatgtgc tccggattgg tcaggcacgg 540ccttcggccc cgcctcctgc caccgcagat tggccgctag gcctccccga gcgccctgcc 600tccgagggcc ggcgcaccat aaaagaagcc gccctagcca cgtcccctcg cagttcggcg 660gtcccgcggg tctgtctcaa gcttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc 720cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccatgccc 780ctggctgcag tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc 840gaggccttgc gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcttgggcg 900ctggggccgc cgcgtgctaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgctaa 960gtctctagcc atttaaaatt tttgataacc agctgcgacg ctttttttct ggcgagatag 1020tcttgtaaat gcgggccagg atctgcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg 1080cgacggggcc cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc 1140accgagaatc ggacgggggt agtctcaaac tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc 1200gccgccgtgt atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg 1260agcggaaaga tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg 1320cccgggagag cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cttcctcatc 1380cgtcgcttca tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttgtc 1440gagcttttgg agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc 1500ccacactgag tgggtggaga ctgaagagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc 1560ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tgcctcattc tcaagcctca gacagtggtt 1620caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaaaactac ccctaaaagc caccggcgag 1680gcgcgccaag tttaaacacc atggcaatga tgtcctctgc tcagttcctt ggtctcctgt 1740tgctctgttt tcaaggtaaa attgactata atgggaattt tgctgttgca cggtgtgata 1800tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga gtcaccatca 1860gttgcagtgc aagtcagggc attagcaatt atttaaactg gtatcagcag aaaccagatg 1920gaactgttaa actcctgatc tattacacat caagtttaca ctcaggagtc ccatcaaggt 1980tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctcaccat cagcaacctg gaacctgaag 2040atattgccac ttactattgt cagcagtata gtaagcttcc tccgtggacg ttcggtggag 2100gcaccaagct ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat 2160ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc 2220ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg 2280agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc 2340tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc 2400tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttagagggac ctagctggcc 2460agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa 2520atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 2580
31
CN 111617261 A
序 列 表
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taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 2640ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt atggaaatgt taattaacta 2700gccatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 2760aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 2820aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2880ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 2940tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 3000ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 3060cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 3120agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 3180gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 3240ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 3300tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 3360tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 3420cacatgttct taattaacct gcaggcgaaa ctcagcttcc ttcgtttccg acttttccat 3480ccgcgtcctc cacttccccg ttccgccctc ccccattgcc aacattctgg ctgagtcacg 3540gcgccccaga gcgcgccagg ctgggggaaa ggagcagaag ggagggccct agcgacccgc 3600gggatgtggt ccgagtcacg tccgaggggg gtggggaggg atcgtgttct cggcgcccgc 3660cccttcctag cgcggcctct gggctgcgcc tctcgggggc ggcccgtagc ccagtccgtc 3720gactagttcc gccagagcgc gcgagggcct ccagcggccg cccctccccc acagcagggg 3780cggggtcccg cgctcaccgg aaggagcggg ctcggggcgg gcggcgctga ttggccgggg 3840cgggcctgac gccgacgcgg ctataagaga ccacaagcga cccgcagggc cagacgttct 3900tcgccgaagc ttgccgtcag aacgcaggtg aggggcgggt gtggcttccg cgggccgccg 3960agctggaggt cctgctccga gcgggccggg ccccgctgtc gtcggcgggg attagctgcg 4020agcattcccg cttcgagttg cgggcggcgc gggaggcaga gtgcgaggcc tagcggcaac 4080cccgtagcct cgcctcgtgt ccggcttgag gcctagcgtg gtgtccgcgc cgccgccgcg 4140tgctactccg gccgcactct ggtctttttt ttttttgttg ttgttgccct gctgccttcg 4200attgccgttc agcaataggg gctaacaaag ggagggtgcg gggcttgctc gcccggagcc 4260cggagaggtc atggttgggg aggaatggag ggacaggagt ggcggctggg gcccgcccgc 4320cttcggagca catgtccgac gccacctgga tggggcgagg cctggggttt ttcccgaagc 4380aaccaggctg gggttagcgt gccgaggcca tgtggcccca gcacccggca cgatctggct 4440tggcggcgcc gcgttgccct gcctccctaa ctagggtgag gccatcccgt ccggcaccag 4500ttgcgtgcgt ggaaagatgg ccgctcccgg gccctgttgc aaggagctca aaatggagga 4560cgcggcagcc cggtggagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaagag ggcctggtcc 4620ctcaccggct gctgcttcct gtgaccccgt ggtcctatcg gccgcaatag tcacctcggg 4680cttttgagca cggctagtcg cggcgggggg aggggatgta atggcgttgg agtttgttca 4740catttggtgg gtggagacta gtcaggccag cctggcgctg gaagtcattt ttggaatttg 4800tccccttgag ttttgagcgg agctaattct cgggcttctt agcggttcaa aggtatcttt 4860taaacccttt tttaggtgtt gtgaaaacca ccgctaattc aaagcaaccg gtcgcacgcg 4920
32
CN 111617261 A
序 列 表
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tagatatccg tcatgaaagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 4980tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 5040gagccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 5100gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 5160agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 5220gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 5280cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 5340atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 5400gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 5460cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 5520gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 5580atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 5640cccccatccc gggacgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 5700ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 5760aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 5820gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 5880ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaagc aggaaatcgt 5940gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa 6000tcttttgtga tggaaaactt ttcttcgtac cacgggacta aacctggtta tgtagattcc 6060attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg 6120aaagggtttt atagtaccga caataaatac gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa 6180aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag 6240gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa actattaaga aagagttagg tttaagtctc 6300actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt 6360gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc gctgagggga gttctagcgt ttcctatatt 6420aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt 6480ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt 6540gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg 6600gataaaacta agacaaagat agagtctttg aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg 6660agcgaaagtc ccaataaaac agtatctgag gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt 6720catcaaacgg cattagagca tcctgaattg tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat 6780cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg tgggcagtaa acgttgcgca agttatagat 6840ctcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca actgctgctc tttcgatact tcctggtatc 6900ggtagcgtaa tgggcattgc agacggtgcc gttcaccaca atacagaaga gatagtggca 6960caatcaatag ctttatcgtc tttaatggtt gctcaagcta ttccattggt aggagagcta 7020gttgatattg gtttcgctgc atataatttt gtagagagta ttatcaattt atttcaagta 7080gttcataatt cgtataatcg tcccgcgtat tctccggggc ataaaacgca accatttctt 7140catcaccatc atcaccaccc taggagcagg tttccccaat gacacaaaac gtgcaacttg 7200aaactccgcc tggtctttcc aggtctagaa gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta 7260
33
CN 111617261 A
序 列 表
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aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga agggccttga 7320gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta 7380tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa 7440atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg 7500tgaggctgca aacagctaat gcacattggc aacagcccct gatgcctatg ccttattcat 7560ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg atttggaggt taaagttttg ccatgctgta 7620ttttagaatt cctgcaggag tcaatgggaa aaacccattg gagccaagta cactgactca 7680atagggactt tccattgggt tttgcccagt acataaggtc aatagggggt gagtcaacag 7740gaaagtccca ttggagccaa gtacattgag tcaataggga ctttccaatg ggttttgccc 7800agtacataag gtcaatggga ggtaagccaa tgggtttttc ccattactga catgtatact 7860gagtcattag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaata ggggtgaatc 7920aacaggaaag tcccattgga gccaagtaca ctgagtcaat agggactttc cattgggttt 7980tgcccagtac aaaaggtcaa tagggggtga gtcaatgggt ttttcccatt attggcacat 8040acataaggtc aataggggtg actagtcagt gggcagagcg cacatcgccc ccgagaagtt 8100ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga 8160aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag 8220tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa 8280gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc 8340acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc 8400cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag 8460cctacctaga ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt 8520ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacaaa 8580cagtagttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gactcactat 8640aggagggcca tcatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc 8700gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac 8760gacttcgctg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag 8820gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc 8880gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag 8940atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg 9000cactttgtgg cagaggagca ggactaaatc tagaattatc cctaatacct gccaccccac 9060tcttaatcag tggtggaaga acggtctcag aactgtttgt ttcaattggc catttaagtt 9120tagtagtaaa agactggtta atgataacaa tgcatcgtaa aaccttcaga aggaaaggag 9180aatgttttgt ggaccacttt ggttttcttt tttgcgtgtg gcagttttaa gttattagtt 9240tttaaaatca gtacttttta atggaaacaa cttgaccaaa aatttgtcac agaattttga 9300gacccattaa aaaagttaaa tgagaaacct gtgtgttcct ttggtcaaca ccgagacatt 9360taggtgaaag acatctaatt ctggttttac gaatctggaa acttcttgaa aatgtaattc 9420ttgagttaac acttctgggt ggagaatagg gttgttttcc ccccacataa ttggaagggg 9480aaggaatatc atttaaagct atgggagggt tgctttgatt acaacactgg agagaaatgc 9540agcatgttgc tgattgcctg tcactaaaac aggccaaaaa ctgagtcctt gggttgcata 9600
34
CN 111617261 A
序 列 表
22/33页
gaaagctg 9608<210> 16<211> 377<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段CD45 Ab重链<400> 16atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taaaattgac 60tataatggga attttgctgt tgcacggtgt gatatccaga tgacacagac tacatcctcc 120ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc 180aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctattac 240acatcaagtt tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat 300tattctctca ccatcagcaa cctggaacct gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag 360tatagtaagc ttcctcc 377<210> 17<211> 31<212> DNA<213> 人工<223> CD45 Ab-H-F-EcoRV<400> 17gatatcatga gcgtgctgat tcttttgtgg c 31<210> 18<211> 26<212> DNA<213> 人工<223> 引物CD45 Ab-H-R-NheI<400> 18gctagctact ggtacttcga tgtctg 26<210> 19<211> 432<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段CD45 Ab H<400> 19gatatcatga gcgtgctgat tcttttgtgg ctgttcacag cctttcctgg tgagtgtatc 60ctgtctgatg tgcagcttca ggagtcagga cctggcctgg tgaaaccttc tcagtcactt 120tccctcacct gcactgtcac tggctactcc atcaccagtg gttatgactg gaactggatc 180cggcagtttc caggaaacaa actggagtgg atgggctaca taagctacag tgtagcaagt 240actacaaccc atctctcaaa agtcgaatct ctatcactcg agacacatcc aagaaccagt 300
35
CN 111617261 A
序 列 表
23/33页
tctccctgga atattctgct actgaggaca cagccacata ttactgtgca agaggtagct 360actaccgtag taataaacgg agacggtgac cgtggtccct gtgccccaga catcgaagta 420ccagtagcta gc 432<210> 20<211> 22<212> DNA<213> 人工<223> 引物Dph7-gRNA-F<400> 20tgttgatgct tctctttctc ca 22<210> 21<211> 20<212> DNA<213> 人工<223> 引物Dph7-gRNA-R<400> 21tctgaaccag tgtccagcac 20<210> 22<211> 10847<212> DNA<213> 人工<223> 基因工程质粒pX260a-GPF-Dph 7<400> 22gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240cgaaacaccg ggttttagag ctatgctgtt ttgaatggtc ccaaaactgt tgatgcttct 300ctttctccag ttttagagct atgctgtttt gaatggtccc aaaacttttt ctagcgcgtg 360cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc 420ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caatagtaac gccaataggg 480actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 540caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 600tggcattgtg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 660ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 720tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 780atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 840ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 900ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 960
36
CN 111617261 A
序 列 表
24/33页
ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 1020gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 1080tccgggctgt aattagctga gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt 1140attaatgttt aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggaccggt 1200gccaccatgg actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa 1260gacgatgacg ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca 1320gcagccgaca agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc 1380gtgatcaccg acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac 1440cggcacagca tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc 1500gaggccaccc ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc 1560tgctatctgc aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac 1620agactggaag agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc 1680ggcaacatcg tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga 1740aagaaactgg tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc 1800cacatgatca agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc 1860gacgtggaca agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac 1920cccatcaacg ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc 1980agacggctgg aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga 2040aacctgattg ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc 2100gaggatgcca aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg 2160gcccagatcg gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc 2220atcctgctga gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc 2280tctatgatca agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg 2340cggcagcagc tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac 2400gccggctaca ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc 2460ctggaaaaga tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg 2520cggaagcagc ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg 2580cacgccattc tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag 2640atcgagaaga tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac 2700agcagattcg cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag 2760gaagtggtgg acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat 2820aagaacctgc ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc 2880gtgtataacg agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc 2940ctgagcggcg agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg 3000accgtgaagc agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa 3060atctccggcg tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa 3120attatcaagg acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc 3180gtgctgaccc tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat 3240gcccacctgt tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg 3300
37
CN 111617261 A
序 列 表
25/33页
ggcaggctga gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc 3360ctggatttcc tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac 3420gacagcctga cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc 3480ctgcacgagc acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag 3540acagtgaagg tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc 3600gtgatcgaaa tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag 3660agaatgaagc ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac 3720cccgtggaaa acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg 3780cgggatatgt acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac 3840catatcgtgc ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga 3900agcgacaaga accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg 3960aagaactact ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat 4020ctgaccaagg ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga 4080cagctggtgg aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg 4140aacactaagt acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag 4200tccaagctgg tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac 4260aactaccacc acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa 4320aagtacccta agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg 4380aagatgatcg ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac 4440agcaacatca tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag 4500cggcctctga tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat 4560tttgccaccg tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag 4620gtgcagacag gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg 4680atcgccagaa agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg 4740gcctattctg tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt 4800gtgaaagagc tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc 4860gactttctgg aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct 4920aagtactccc tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa 4980ctgcagaagg gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc 5040agccactatg agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg 5100gaacagcaca agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga 5160gtgatcctgg ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat 5220aagcccatca gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga 5280gcccctgccg ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc 5340aaagaggtgc tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg 5400atcgacctgt ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag 5460gcaaaaaaga aaaagtaaga attcgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc 5520gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc 5580cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 5640
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CN 111617261 A
序 列 表
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ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag 5700ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 5760accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg 5820caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat 5880ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 5940tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa 6000acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata 6060tggccacaac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 6120tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 6180atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 6240cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 6300accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 6360gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 6420gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 6480tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 6540agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 6600tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 6660ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 6720atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 6780tgtacaagta agaattccga tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgtat 6840gctatacgaa gttattaggt ctgaagagga gtttacgtcc agccaagctt aggatctcga 6900cctcgaaatt ctaccgggta ggggaggcgc ttttcccaag gcagtctgga gcatgcgctt 6960tagcagcccc gctgggcact tggcgctaca caagtggcct ctggcctcgc acacattcca 7020catccaccgg tagcgccaac cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc caccttctac 7080tcctccccta gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca ggacgtgaca 7140aatggaagta gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa 7200gcgggtaggc ctttggggca gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca 7260gcagctggga agggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc 7320gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg 7380ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca tccatctaga tctcgagcag 7440ctgaagctta ccatgaccga gtacaagccc acggtgcgcc tcgccacccg cgacgacgtc 7500cccagggccg tacgcaccct cgccgccgcg ttcgccgact accccgccac gcgccacacc 7560gtcgatccgg accgccacat cgagcgggtc accgagctgc aagaactctt cctcacgcgc 7620gtcgggctcg acatcggcaa ggtgtgggtc gcggacgacg gcgccgcggt ggcggtctgg 7680accacgccgg agagcgtcga agcgggggcg gtgttcgccg agatcggccc gcgcatggcc 7740gagttgagcg gttcccggct ggccgcgcag caacagatgg aaggcctcct ggcgccgcac 7800cggcccaagg agcccgcgtg gttcctggcc accgtcggcg tctcgcccga ccaccagggc 7860aagggtctgg gcagcgccgt cgtgctcccc ggagtggagg cggccgagcg cgccggggtg 7920cccgccttcc tggagacctc cgcgccccgc aacctcccct tctacgagcg gctcggcttc 7980
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CN 111617261 A
序 列 表
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accgtcaccg ccgacgtcga ggtgcccgaa ggaccgcgca cctggtgcat gacccgcaag 8040cccggtgcct gacgcccgcc ccacgacccg cagcgcccga ccgaaaggag cgcacgaccc 8100catgcatcga tgatatcaga tccccgggat gcagaaattg atgatctatt aaacaataaa 8160gatgtccact aaaatggaag tttttcctgt catactttgt taagaagggt gagaacagag 8220tacctacatt ttgaatggaa ggattggagc ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 8280atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 8340cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 8400cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 8460ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 8520cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 8580ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 8640tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 8700ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 8760aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 8820gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct 8880cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt 8940ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 9000ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 9060gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 9120acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 9180tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 9240agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 9300cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 9360aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg 9420gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 9480agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 9540aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 9600gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 9660ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc 9720aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 9780aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 9840tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt ggaagccgcg gtatcattgc 9900agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 9960ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 10020ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 10080ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 10140acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 10200agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 10260ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 10320
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CN 111617261 A
序 列 表
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cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 10380gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 10440cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 10500gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 10560caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 10620aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 10680tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 10740gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 10800ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgt 10847<210> 23<211> 25<212> DNA<213> 人工<223> 引物Dph7-Screen-F<400> 23cttcctcaca gacagagtca cccag 25<210> 24<211> 22<212> DNA<213> 人工<223> 引物Dph7-Screen-R<400> 24cgagaagggc ccgagagcct cc 22<210> 25<211> 908<212> DNA<213> 人工<223> 基因片段Dph7 screen<400> 25cttcctcaca gacagagtca cccaggggag cttcctcaca gacagagtca cccaggggag 60cttcctcaca gacagagtca tccaggggag cttcctcaca gacagagtca cccaggggag 120cttcctcaca gacagagtca cccaggggag cttcctcaca gacagagtca cccaggggag 180cttcctcaca gacagagtca cccaggggag cttcctcaca gacagagtca cccaggggag 240cttcctcaca gacagagtca ccccggggag cttcctcaca gacagtcacc caggggagct 300tcctcacaga cagtcaccca ggggagcttc ctcacagaca gagtcatcca ggggagcttc 360ctcacagaca gagtcaccca ggggagcttc ctcacagaca gagtcaccca ggggagcttc 420ctcacagaca gtcaccccgg ggagcttcct cacagacagt cacccagggg agcttcctca 480cagacagagt caccccgggg agcttcctca cagacagtca ccccggggag cttcctcaca 540gacatcaacg gcctaactga gaacactcat ttcctgtcat tagtggtgtt gatgcttctc 600
41
CN 111617261 A
序 列 表
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tttctccaca cagggggcga cgatggcctt ctgaggggct gggacaccag ggtacccggc 660aaatttctct tcaccagcaa aaggtaactg cccaagggcc agcactcggt gcccacacca 720gcccccgcgt tccctgggtc accagccctc ccgttccctg ggtgggtctg tgtgctggac 780actggttcag aagccgcctc tgcttgcaga cacaccatgg gtgtgtgcag catccagagc 840agccctcatc gggagcacat cctggccacg ggaaggtgag tccccaggag gctctcgggc 900ccttctcg 908<210> 26<211> 41<212> DNA<213> 人工<223> 引物DTA-F-BamHI<400> 26accaccggat ccatgggcgc tgatgatgtt gttgattctt c 41<210> 27<211> 34<212> DNA<213> 人工<223> 引物DTA-R(EcoRI)<400> 27accaccgaat tcttagtggg aattagtcat gccc 34<210> 28<211> 1200<212> DNA<213> 白喉杆菌<223> 基因片段DTA<400> 28accaccggat ccatgggcgc tgatgatgtt gttgattctt ctaaatcttt tgtgatggaa 60aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 120caaaagccaa aatctggtac acaaggaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt 180accgacaata aatacgacgc tgcgggatac tctgtagata atgaaaaccc gctctctgga 240aaagctggag gcgtggtcaa agtgacgtat ccaggactga cgaaggttct cgcactaaaa 300gtggataatg ccgaaactat taagaaagag ttaggtttaa gtctcactga accgttgatg 360gagcaagtcg gaacggaaga gtttatcaaa aggttcggtg atggtgcttc gcgtgtagtg 420ctcagccttc ccttcgctga ggggagttct agcgtttcct atattaataa ctgggaacag 480gcgaaagcgt taagcgtaga acttgagatt aattttgaaa cccgtggaaa acgtggccaa 540gatgcgatgt atgagtatat ggctcaagcc tgtgcaggaa atcgtgtcag gcgatcagta 600ggtagctcat tgtcatgcat aaatcttgat tgggatgtca taagggataa aactaagaca 660aagatagagt ctttgaaaga gcatggccct atcaaaaata aaatgagcga aagtcccaat 720aaaacagtat ctgaggaaaa agctaaacaa tacctagaag aatttcatca aacggcatta 780
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序 列 表
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gagcatcctg aattgtcaga acttaaaacc gttactggga ccaatcctgt attcgctggg 840gctaactatg cggcgtgggc agtaaacgtt gcgcaagtta tagatctcga aacagctgat 900aatttggaaa agacaactgc tgctctttcg atacttcctg gtatcggtag cgtaatgggc 960attgcagacg gtgccgttca ccacaataca gaagagatag tggcacaatc aatagcttta 1020tcgtctttaa tggttgctca agctattcca ttggtaggag agctagttga tattggtttc 1080gctgcatata attttgtaga gagtattatc aatttatttc aagtagttca taattcgtat 1140aatcgtcccg cgtattctcc ggggcataaa acgcaaccat ttctttaaga attcggtggt 1200<210> 29<211> 7185<212> DNA<213> 人工<223> TR细胞株检测载体pMyc-DTA-IRES-GFP<400> 29ctgcataatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta gcttaagtaa cgccattttg 60caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat agaaaagttc agatcaaggt caggaacaga 120tggaacagct gaatatgggc caaagcggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc 180agggccaaga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag 240ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtcca gccctcagca 300gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc 360cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg 420agctcaataa aagagcccac aacccctcac tcggggcgcc agtcctccga ttgactgagt 480cgcccgggta cccgtattcc caataaagcc tcttgctgtt tgcatccgaa tcgtggactc 540gctgatcctt gggagggtct cctcagattg attgactgcc cacctcgggg gtctttcatt 600tggaggttcc accgagattt ggagacccca gcccagggac caccgacccc cccgccggga 660ggtaagctgg ccagcggtcg tttcgtgtct gtctctgtct ttgtgcgtgt ttgtgccggc 720atctaatgtt tgcgcctgcg tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc 780cgtggtggaa ctgacgagtt cggaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac 840ttcgggggcc gtttttgtgg cccgacctga gtccaaaaat cccgatcgtt ttggactctt 900tggtgcaccc cccttagagg agggatatgt ggttctggta ggagacgaga acctaaaaca 960gttcccgcct ccgtctgaat ttttgctttc ggtttgggac cgaagccgcg ccgcgcgtct 1020tgtctgctgc agcatcgttc tgtgttgtct ctgtctgact gtgtttctgt atttgtctga 1080aaatatgggc ccgggccaga ctgttaccac tcccttaagt ttgaccttag gtcactggaa 1140agatgtcgag cggatcgctc acaaccagtc ggtagatgtc aagaagagac gttgggttac 1200cttctgctct gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg ccgcgagacg gcacctttaa 1260ccgagacctc atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca cctggcccgc atggacaccc 1320agaccaggtc ccctacatcg tgacctggga agccttggct tttgaccccc ctccctgggt 1380caagcccttt gtacacccta agcctccgcc tcctcttcct ccatccgccc cgtctctccc 1440ccttgaacct cctcgttcga ccccgcctcg atcctccctt tatccagccc tcactccttc 1500tctaggcgcc cccatatggc catatgagat cttatatggg gcacccccgc cccttgtaaa 1560
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cttccctgac cctgacatga caagagttac taacagcccc tctctccaag ctcacttaca 1620ggctctctac ttagtccagc acgaagtctg gagacctctg gcggcagcct accaagaaca 1680actggaccga ccggtggtac ctcaccctta ccgagtcggc gacacagtgt gggtccgccg 1740acaccagact aagaacctag aacctcgctg gaaaggacct tacacagtcc tgctgaccac 1800ccccaccgcc ctcaaagtag acggcatcgc agcttggata cacgccgccc acgtgaaggc 1860tgccgacccc gggggtggac catcctctag actgccggat ccaccaccgg atccatgggc 1920gctgatgatg ttgttgattc ttctaaatct tttgtgatgg aaaacttttc ttcgtaccac 1980gggactaaac ctggttatgt agattccatt caaaaaggta tacaaaagcc aaaatctggt 2040acacaaggaa attatgacga tgattggaaa gggttttata gtaccgacaa taaatacgac 2100gctgcgggat actctgtaga taatgaaaac ccgctctctg gaaaagctgg aggcgtggtc 2160aaagtgacgt atccaggact gacgaaggtt ctcgcactaa aagtggataa tgccgaaact 2220attaagaaag agttaggttt aagtctcact gaaccgttga tggagcaagt cggaacggaa 2280gagtttatca aaaggttcgg tgatggtgct tcgcgtgtag tgctcagcct tcccttcgct 2340gaggggagtt ctagcgtttc ctatattaat aactgggaac aggcgaaagc gttaagcgta 2400gaacttgaga ttaattttga aacccgtgga aaacgtggcc aagatgcgat gtatgagtat 2460atggctcaag cctgtgcagg aaatcgtgtc aggcgatcag taggtagctc attgtcatgc 2520ataaatcttg attgggatgt cataagggat aaaactaaga caaagataga gtctttgaaa 2580gagcatggcc ctatcaaaaa taaaatgagc gaaagtccca ataaaacagt atctgaggaa 2640aaagctaaac aatacctaga agaatttcat caaacggcat tagagcatcc tgaattgtca 2700gaacttaaaa ccgttactgg gaccaatcct gtattcgctg gggctaacta tgcggcgtgg 2760gcagtaaacg ttgcgcaagt tatagatctc gaaacagctg ataatttgga aaagacaact 2820gctgctcttt cgatacttcc tggtatcggt agcgtaatgg gcattgcaga cggtgccgtt 2880caccacaata cagaagagat agtggcacaa tcaatagctt tatcgtcttt aatggttgct 2940caagctattc cattggtagg agagctagtt gatattggtt tcgctgcata taattttgta 3000gagagtatta tcaatttatt tcaagtagtt cataattcgt ataatcgtcc cgcgtattct 3060ccggggcata aaacgcaacc atttctttaa gaattcctgc aggcctcgag gcggccgcta 3120cgtaaattcc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa 3180taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat 3240gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct 3300ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct 3360tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc 3420gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa 3480ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc 3540gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg 3600gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc 3660cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 3720gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 3780gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 3840aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 3900
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gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 3960cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 4020aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 4080aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 4140ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 4200atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 4260cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 4320ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 4380ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaagc 4440ggcccagcca cagtggtcga ccgggccgcc agcacagtgg gggggggccc gcgattagtc 4500caatttgtta aagacaggat atcagtggtc caggctctag ttttgactca acaatatcac 4560cagctgaagc ctatagagta cgagccatag atagaataaa agattttatt tagtctccag 4620aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaagccat 4680tttgcaaggc atggaaaaat acataactga gaatagagaa gttcagatca aggttaggaa 4740cagagagaca ggagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 4800ctcagggcca agaacagttg gaacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 4860cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 4920gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aatgaccctg 4980tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc tgttcgcgcg cttctgctcc 5040ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct cactcggcgc gccagtcctc cgatagactg 5100cgtcgcccgg gtacccgtgt atccaataaa ccctcttgca gttgcatccg acttgtggtc 5160tcgctgttcc ttgggagggt ctcctctgag tgattgacta cccgtcagcg ggggtctttc 5220attctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 5280tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 5340gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 5400atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 5460ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 5520cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 5580tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 5640gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 5700aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 5760tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 5820aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 5880aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 5940ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 6000ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 6060atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 6120atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgc ggccggccgc aaatcaatct 6180aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 6240
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tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 6300ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 6360gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 6420gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 6480taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 6540tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 6600ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 6660tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 6720ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 6780tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata 6840ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 6900aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 6960actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 7020aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 7080tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 7140aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttc 7185<210> 30<211> 22<212> DNA<213> 人工<223> Dph7 gRNA序列<400> 30tgttgatgct tctctttctc ca 22
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