高效液相色谱法测定人血浆中百草枯质量分数孙斌栾春业吴立强杜海玲刘玉芳邱建清【摘要】目的建立人血浆中百草枯质量分数高效液相色谱检测方法，为百草枯中毒患者预后评估、治疗方案选择提供方法学支持。方法样品处理采用３５％高氯酸处理。流动相为０．１ｔｏｏｌ・Ｌ“磷酸缓冲液（含７５ｍｍｏｌ・Ｌ“庚烷磺酸钠）－乙腈（８８：１２，三乙胺凋ｐＨ＝３．０）；流速：１．０ｗ．Ｌ・ｍｉｎ～；柱温２８℃；检测波长２５８ｎｍ。结果所采用方法在０．２～５００ｔｒｇ・ｍＬ“范围内线性关系良好。平均绝对回收率为１００．６％，ＲＳＤ均小于３％；平均相对回收率为１０１．３１％，ＲＳＤ均小于６％。日内和日间ＲＳＤ均小于６％，冻融及冻存后百草枯样品质量分数测定结果无显著性差异。结论该法快速，准确、血液中杂质无干扰，适用于百草枯中毒患者血药质量分数的分析测定。Ｉ关键词】百草枯；高效液相色谱法；血药质量分数钠（国药集团化学试剂有限公司批号２０１１０５１１），乙腈、甲醇、三乙胺均为色谱纯，１．２研究方法１．２．１百草枯（ＰＱ）是目前广泛应用的有机杂环类除草剂，对人畜具有高毒性…。口服中毒为其主要中毒途径，文献对于人口服白草枯致死量的报道不尽一致，有报道心Ｊ，２０％百草枯溶液为５～１５ｍｇ・ｋｇ～。目前临床尚无有效治疗方法，百草枯经血液循环分布于肺、肝、肾、甲状腺、肌肉中，造成多器官系统功能损害，是百草枯中毒死亡的主要原因。血液中百草枯质量分数与救治成活率密切相关，并可早期预测患者预后。对于百草桔的分析色谱条件色谱柱：Ｕｔｉｍａｔｅ＠ＸＢ－Ｃ１８分ｔｔｍ）；流动相为０．１析柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５ｍｍｏｌ・Ｌ一磷酸缓冲液（含７５ｍｍｏｌ・Ｌ叫庚烷磺酸钠）－乙腈（８８：１２，三乙胺调ｐＨ＝３．０）；流速Ｉ１．０ｍｌ＿／ｍｉｎ；柱温２８℃；检测波长２５８ｎｎｌ。１．２．２标准工作液的配制品２．０ｍｇ置于１．０ｍＬ精密称取百草枯标准检测方法有紫外分光光度法、色谱法等多种方法１３１其提取方法也有液一液萃取法、固相萃取法等很多种Ｈ。Ｊ，操作繁琐，费时费力，不利于临床实践应用，本文采用简单的蛋白沉淀法处理血浆样本，建立专一、灵敏、快速的高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）检测血浆中百草枯质量分数，可为评估患者中毒程度，建立百草枯中毒预后判断指标，评价临床治疗方案效果提供方法学支持。ＥＰ管中，以纯水溶解并定容至刻度，得质量分数为２０００．０峭・ｍＬ“的百草枯储备液，４℃冰箱内避光储存。用时取储备液用纯水逐级稀释，配成含百草枯质量分数分别为２，２０，２００ｔｔｇ・ｍＬ。１的百草枯系列标准溶液。１．２．３样品处理取样品０．５ｍＬ置ＥＰ管中，加入３５％高氯酸１００ｔｔＬ，涡漩１ｍｉｎ，低温高速１３０００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｒａｉｎ，取上清液２０斗Ｌ进行高效１资料与方法１．１仪器与试剂福立ＦＬ２２００ＩＩ高效液相色谱仪，配有色谱工作站，ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ心机，ＩＫＡＡＧ２２３３１ｍｉｎｉｓｐｉｎ液相色谱分析１．２．４方法专一性分别取空白血浆、２００Ｉｘｇ・ｍＬ一百草枯标准溶液、空白血浆＋２００峭・ｍＬ。百草枯标准溶液、待测血浆样品，按“１．２．３“项下方法操作，得色谱图，确定百草枯出峰时间，排除血浆中的内源性物质对百草枯测定的干扰。１．２．５标准曲线建立精密吸取百草枯标准溶液适量，分别加入到空白血浆中，得百草枯质量分数为０。２。０．５，２，５，２０，５０，２００，５００；ｔｇ・ｍＬ叫的血浆样品。照“１．２．３”项下方法操作后，上述色谱条件下进行分析，分别以质量分数（Ｙ）对峰ｐｌｕｓ高速台式离ＶＯＲＴＥＸｇｅｎｉｕｓ．３涡旋混合器，梅特勒．托利多ＡＬ－２０４分析天平，百草枯标准品（上立方联合化工技术研究院批号２０１０７０３８），ｌ・庚烷磺酸作者单位：２５６６０３科山东省滨州市，滨州医学院附属医院急诊面积（ｘ）做线性回归，得血浆百草枯质量分数回归方程，并检测百草枯质量分数定量下限。１．２．６绝对回收率于空白血浆中加人适量不同质量分数百草枯标准溶液，使百草枯质量分数分别为２，２０，２００ｌａｇ・ｍＬ～，按“１．２．３“项下方法处理，同时测定相应质量分数的百草枯标准溶液。将血浆样品中与相应标准溶液中的百草枯峰面积进行比较，测得绝对回收率。１．２．７相对回收率于空白血浆中加入适量不同质量分数百草枯标准溶液，使百草枯质量分数分别为２，２０，２００斗ｇ・ｍＬ～，按“１．２．３”项下方法处理，每个质量分数平行测定５份样本，计算相对回收率，评价方法的准确度。１．２．８批内和批间精密度２０，２００斗ｇ・ｍＬ一质量分数梯度的百草枯系列溶液，按时间分为原点、一２０℃冻融１次、冻融２次、一２０℃存放ｌｄ、存放７ｄ。按“１．２．３”项下方法处理，每个质量分数在每个时间点平行测定５份样本，分别用当日标准曲线计算测得质量分数，评价一２０℃冻融与存放时间百草枯稳定性的影响。１．３统计学方法计量数据以均数±标准差（孑±ｓ）表示，测试结果的精密度以相对标准偏差（ＲＳＤ）来表示，三组间均数的比较采用方差分析，两两比较采用ＬＳＤ法。采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行统计学处理，以Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义。２以空白血浆配制２，２．１结果方法专一性在本实验色谱条件下，血浆中百草枯峰形良ｐ．ｇ・ｍＬ。１质量分数梯度的百草枯系列溶液，按“１．２．３’项下方法处理，此为１个分析批；连续３天，每天测定１个分析批，分别用当日标准曲线计算测得质量分数。计算日内和日间的相对标准差（ＲＳＤ），评价方法的精密度。１．２．９稳定性试验以空白血浆配制２，２０，２００好，分离完全，不受血浆内杂质蜂干扰。百草枯保留时间为７ｍｉｎ左右。本方法具有较好的专一性。见图１。ａ空白血浆ｂ２００ｐｇ・ｍＬ－１百草枯标准溶液ｃ空白血浆＋２００ＩＩｇ．ｍＬｑ百草枯标准溶液ｄ待测血浆样品图１百草枯高效液相色谱图２．２线性范围与检出限百草枯的标准曲线回归方程为Ｙ＝０．００００１ｌｘ一０．９９５６，ｒ＝Ｏ．９９８，ｙ为百草枯的质量分数（峭・ｍＬ’１），菇为峰面积。表明百草枯在０．２—５００・１５０・Ｉｘｇ・ｍＬ。１范围内线性关系良好。最低检出限（Ｓ／Ｎ＝３）可达０．１Ｐ，ｇ・ｍＬ～。２．３回收率和精密度试验平均绝对回收率为１００．６％，ＲＳＤ均小于３％；平均相对回收率为１０１．３１％，ＲＳＤ均小于６％。日内和日间精密度见表２，ＲＳＤ均小于６％。见表ｌ。表１百草枯回收率（ｒｔ＝５）质量分数绝对回收率％ＲＳＤ％２．７０！竺＝！：！ｆ噬：些：１２２０２００质量分数１面蓟主警募黯１丽ｉ嘉釜筹曩警表２百草枯精密度（托＝５）（丝２３．４０３．１２（挫：吐：１２２０．８２±Ｏ．９３２０３．１７±７．２６（丝２４．４５２１．０９±Ｏ．８０２０４．３８±６．３７３．５７２．４稳定性试验相对回收率％９９．０８±５．６７１０３．９３±５．３８１００．ｑＨ０±４．４１ＲＳＤ％５．７２５．１７４．３７（凹：里生’－：Ｉ２２２０２００反复冻融及冻存不同时间百草枯样品质量分数测定结果见表３、４，三组间及组件两两比较无显著性差异，Ｐ值均大于Ｏ．０５，ＲＳＤ均小于８％，表明上述条件下百草枯样品稳定。９９．７５±２．７０１００．６５±２．５６１０１．４０±２，９４２．５５２．９０表３百草枯冻融稳定性（ｎ＝５）２ｌ±Ｏ６４±土６７２±ＯＯ±土ｉ０●Ｏ±３原冻冻点融融２凑次２●叭∞鳄±他傀地５怕∞盯扎ｍ孤¨；。弱±鲫璩∞ｔ弛加弘拟辨枷＂％乾±９∞昕叭３卯铝∞与原点比较。Ｐ＞０．０５，与冻融１次比较’Ｐ＞０．０５。三组间比较Ｐ＞０．０５。表４百草枯冻存稳定性（ｎ＝５）原点冻存１天冻存７天２．０１±Ｏ．１２２．０１±０．１０‘２．０２±ｏ．１５“６．１６２１．１Ｉ±Ｏ．８０２０．４５４－１．３４＋３．７８６．５６６，９１２０４．１３±６．０６２０８．７１±１１．９９２０４．６８－Ｉ－１２．１５２．９７５．７５。５．９４“５．１７７．２２２０．２４４－１．４０—注：与原点比较‘Ｐ＞０．０５，与冻存ｌ天比较。Ｐ＞Ｏ．０５，三组ｆＢＪ比较Ｐ＞Ｏ．０５。３应用患者，男，３２岁，体质量７２ｋｇ，ＶＩ服２０％百草枯溶液５０ｍＬ后半小时人院。于人院当时，服毒后６、１２、２４、３６、４８ｈ取血浆，按照“１．２．３”质量分数时间曲线见图２。可见患者口服百草枯后，血浆中百草枯质量分数会随时间推移而显著下降，至４８ｈ后已难以测出，因此在临床工作中，要及早进行洗胃，导泻，血液灌流及抗氧自由基等综合治疗，尽最大可能挽救患者生命。项下方法操作，测定血浆中百草枯质量分数，血药孵∞的加坩。入院６ｈ１２ｈ２４ｈ３６ｈ４８ｈ图２百草枯中毒后血药质量分数・时间曲线・１５ｌ・４讨论百草枯的分子式为Ｃ。：Ｈ。。Ｎ：，相对分子质量１８６．３，纯品为白色结晶，以阳离子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇，３０００Ｃ左右分解，在酸性及中性溶液中稳定，可被碱水解，常用的为２０％水溶液。由于其强极性及高沸点，因而液相色谱法尤其是高效液相色谱法是最常用的百草枯检测方法。检测效果和具体分析方法因选择的色谱仪、色谱柱、流动相等的不同而异。通常情况下百草枯液相色谱法选用离子对试剂的流动相、富集特性强的色谱柱，更能获得显著的分析检测结果∞Ｊ。百草枯生物样品的预处理方法多采用固相小柱萃取法”Ｊ。前者成本较高且涉及多种化学试剂，步骤繁杂。本实验参照张雷【７１报道的条件，采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法，简便快捷，且沉淀完全，在检测中枯的保留时问影响较大，庚烷磺酸钠质量分数降低或乙腈比例升高，都会使百草枯保留时间缩短，且有拖尾现象。当柱温为２８℃，水相中庚烷磺酸钠含量为７５ｍｍｏｌ・Ｌ一，乙腈体积比为１２％时，百草枯分离良好，同时避免了血浆中杂峰的干扰，能得到较好色谱图。经方法学验证，其灵敏度、专一性、线性范围、精密度、准确度等，符合生物样品分析方法要求，重现性好，可应用于临床百草枯中毒患者的血药质量分数检测。参考文献［１］ＪｅｒｏｍｅＧ。Ｃｈｅｎ。ＤａｖｉｄＬ，ｅｔａ１．ＰａｒａｑｕａｔＩｎｇｅｓｔｉｏｎ：ＡＣｈａｌｌｅｎｇｉｎｇｅ１５０９．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ［Ｊ】．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，２０１０，１２５（６）：ｅ１５０５・［２］陈灏珠．实用内科学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００５：８０４．８０５．［３］陈辉凤．宋乃国，田喜风．百草枯中毒血、尿标本分析检测方法的研究进展ＥＪ］．实验与检验医学，２００９，２７（６）：６４９・６５１．未见有干扰组分，且获得了较高的回收率，从图Ｉ血浆中百草枯色谱图看，血浆中内源性物质多在６ｒａｉｎ内出峰，不干扰百草枯的测定。本方法选用磷酸溶液作缓冲液，庚烷磺酸钠作离子对试剂，乙腈为有机溶剂，同时用有机碱三乙胺调节ｐＨ。分析结果显示，百草枯峰形良好，保留时间适当，回收率和精密度符合方法学要求，分析过程简单易行。本研究中发现，流动相的存放时间可对百草枯保留时间有一定影响，这可能与流动［４】张婷，谭家镒，田艳。等．气相色谱法检测全血中百草枯［Ｊ］．广东科技，２００７，８９（４）：２１－２２．［５］王朝虹。王志萍，何毅，等．高效液相色谱法测定生物体液中百草枯［Ｊ］．中国法医学杂志。２００７，２２（６）：３８８－３４０．［６］付朝晖，黄雩祥，闵顺耕．反相离子对高效液相色谱法测定血浆中的百草枯［Ｊ］．农药。２００８，４７（１１）：８１４－８１５．［７］王雷，王本杰，孔祥麟，等．高效液相色谱法测定大鼠血浆中百草枯的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００９，２０（４）：６２３－６２６．相中乙腈挥发，导致流动相中乙腈比例降低有关。流动相中庚烷磺酸钠的质量分数及乙腈比例对百草・１５２・高效液相色谱法测定人血浆中百草枯质量分数
作者：作者单位：
孙斌， 栾春业， 吴立强， 杜海玲， 刘玉芳， 邱建清256603 山东省滨州市,滨州医学院附属医院急诊科
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_7556085.aspx
