不同工艺条件对普洱茶渥堆过程中微生物及酶活的影响

Modern Food Science and Technology 2013, Vol.29, No.3

不同工艺条件对普洱茶渥堆过程中

微生物及酶活的影响

胡捷，刘通讯

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 5100）

摘要：运用实验室规模模拟渥堆，通过正交实验，研究不同工艺条件(初始水分含量、初始pH值和翻堆间隔)对普洱茶渥堆过程中微生物(霉菌)和酶活(多酚氧化酶、纤维素酶和果胶酶)的影响。结果表明：渥堆过程中，初期霉菌大量生长，随后趋于稳定。多酚氧化酶活性呈现增-减-增、先增后减和增-减-增-减3种变化趋势，纤维素酶和果胶酶酶活性呈现先增后减的变化趋势，仅酶活性峰值大小和出现时间不同。其中40~45%的初始水分含量能使茶胚渥堆过程中霉菌和各类酶活性维持在较高水平，调整茶胚的初始pH值对渥堆过程中微生物和酶活的影响不显著，翻堆间隔在8 d有利于茶胚霉菌保持在高水平，翻堆间隔在6 d有利于酶活保持在高水平。以茶褐素含量、茶多酚和儿茶素总量作为普洱茶氧化程度的指标，表明初始水分含量过高(50%)、翻堆间隔频率过高或过低(4 d、8 d)会引起普洱茶氧化过度，导致其品质下降。因此，选择合适的工艺条件有利于普洱茶品质提高。

关键词：普洱茶；霉菌；酶活；渥堆；工艺 文章篇号：1673-9078(2013)3-571-575

Effect of Different Process Conditions on Microbes and Enzyme Activities during the Pile-fermentation of Pu-erh Tea

HU Jie, LIU Tong-xun (College of Light and food Science, South China University of Technology, Guangzhou 5100, China) Abstract: Effect of different process conditions on microbes (mould) and enzyme activities(polyphenol oxidase, cellulase and pectinase) during the pile-fermentation of Pu-erh tea was studied by orthogonal experiment in laboratory-scale. During pile-fermentation process, mould was growth in large number at the beginning then remained stable. Polyphenol oxidase exhibited 3 kinds of trends which were increase-less-increased, decreased after increasing and increase-less-increase-less. Cellulase and pectinase exhibited similar change trend that was decreased after increasing with various peak value and appearance time. In addition, mould and enzyme activities were remained at a high level by initial moisture content controlled in the range of 40% to 45%. There was no effect on mould and enzyme activities by pH modification. Mould was remained at a high level by turning intervals in 8 days and enzyme activities were remained at a high level by turning intervals in 6 days. Based on the contents of theabrownin, tea polyphenol and catechins, it indicated that Puerh tea would be excessive oxidation under high level initial moisture content (50%) and too high or too low turning interval frequency(4 d, 8 d). Therefore, proper process will benefit the quality improvement of Pu-erh tea. Key words: Pu-erh tea; mould; enzyme activities; pile-fermentation; process

普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料，在特定的环境条件下，经微生物、酶和湿热等综合氧化作用，其内含物质发生一系列转化，从而形成独特品质特征[1]

代谢对其安全性影响[6]以及渥堆过程中微生物动态变

化[7]及分离鉴定[8~9]。

渥堆无疑是普洱熟茶品质形成的关键工序，但是对影响渥堆的工艺条件如潮水(初始水分含量)、调整茶胚初始pH环境以及翻堆间隔与渥堆的相关关系未见报道。本研究以云南大叶种晒青毛茶为原料，通过设计正交实验，在不同工艺条件下进行渥堆，研究对其渥堆过程中微生物(霉菌)、水解酶类(纤维素酶和果胶酶)和氧化酶类(多酚氧化酶)的影响，有利于进一步了解普洱茶渥堆的作用机理，以期为微生物菌种、外

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。国内外学术界为了揭示普洱茶品质形成的机理，

在这方面进行了大量的研究。研究较多的有理化成分分析[2~3]，添加外源物[4~5]，普洱茶渥堆过程中微生物

收稿日期：2012-10-29

作者简介：胡捷(1988-)，男，硕士研究生，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程

通讯作者：刘通讯，男，副教授，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程

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源酶制剂的应用和普洱熟茶生产工艺技术提升提供参考和借鉴。 1 材料与方法

1.1 材料与仪器

晒青毛茶，云南腾冲，2011年。

ESJ200-4电子分析天平，上海精科电子有限公司；SpectrumLab22PC型分光光度计，上海棱光技术有限公司；富华420型三用水箱，金坛市富华仪器有限公司；LRH-250-S型恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂；YX-280D手提式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；GL-21M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；DHG90A电热恒温鼓风干燥箱，上海索普仪器有限公司。 1.2 实验设计 表1 三因素三水平正交设计表 Table 1 Three factors and three levels orthogonal design table 水平 1 2 3 因素 A (初始水分含量/%) B (初始pH值) C (翻堆间隔/d) 40 45 50 5.0 6.0 - 4 6 8 茶多酚总量：GB/T8313-2002；儿茶素总量：香荚兰比色法；茶褐素总量：系统比色法。

1.4 数据分析

数据分析处理采用Microsoft excel 2010和SPSS 17软件。每次实验重复三次，数据以平均值±标准偏差表示。 2 结果与分析

2.1 不同工艺条件下普洱茶渥堆过程中霉菌和酶活变化 晒青毛茶经加水增湿后，霉菌开始大量生长，主要以黑曲霉为主，随后数量趋于稳定(表2)。渥堆过程中，1号组每次翻堆时霉菌平均数稳定在108左右，2、3组数量级稳定在106~108之间，6号组除四翻、六翻时未检出霉菌，其余则维持在105~106之间，4、5、7、8、9组稳定在106~107之间。 原料中多酚氧化酶活性极低，仅0.28±0.08 U/g，经加水增湿后酶活变化非常明显(表2)。实验1、4、8组渥堆过程中，多酚氧化酶酶活性呈现增-减-增变化趋势。其中1、4号组酶活峰值出现在后期堆表，分别为9.65和16.27 U/g，而8号组酶活峰值则出现在初期堆表，达17.55 U/g。实验2、3、6、9组渥堆过程中，多酚氧化酶酶活性呈现先增后减变化趋势，与微生物生长的S型曲线十分相似，说明多酚氧化酶活性可能与渥堆过程中主要微生物消长有关。其中2、3组酶活峰值出现在中期堆表，分别为12.85和5.55 U/g，而6、9组则出现在初期，分别为7.94和12.48 U/g。实验5、7组渥堆过程中，多酚氧化酶酶活性呈现增-减-增-减的双峰变化趋势。酶活出现双峰变化趋势说明，可能是在渥堆过程中由于微生物种群的更迭或微生物新陈代谢活动的周期性[13]。 原料中纤维素酶和果胶酶酶活分别为26±8 μg/(g·min)和1±27 μg/(g·min)，经加水增湿后变化非常明显(表2)。渥堆过程中茶胚纤维素酶和果胶酶酶活性变化总体表现为先增后减的单峰曲线，仅酶活峰值大小和出现时间不同，说明纤维素酶和果胶酶活性同多酚氧化酶一样可能与渥堆过程中主要微生物的消长有关。但是3号组果胶酶例外，其活性初期低于原料值，中后期稳定在215~252 μg/(g·min)，在9组中峰值活性最低。

2.2 初始水分含量、初始pH值和翻堆间隔的三因素三水平实验结果

注：-表示不调整pH值。 根据已有的资料及实际情况，用以自然渥堆的晒青毛茶4 kg，进行三因素（潮水量、潮水pH值、翻堆间隔）三水平正交试验，正交表设计如表1。处理方式：分别准备pH值5.0、6.0的柠檬酸缓冲溶液以及食品用水，用小型喷雾器均匀喷洒在普洱散茶上，使茶堆水分含量在合适范围（40%、45%、50%）。每隔一段时间（4 d、6 d、8 d）进行一次翻堆，并在翻堆前取样。每次翻堆时分别在模拟组堆表(0~5 cm)、堆芯(5~15 cm)取样100 g，混合均匀后，即为堆表样、堆芯样。采样后立即进行水分含量测定，微生物测定和酶液制备(时间间隔不超过2 h)。渥堆24 d后，将茶叶摊开室内晾干，干燥后测定茶多酚总量、儿茶素总量和茶褐素总量。 1.3 测定指标及方法 茶胚水分含量：GB/T8304-2002，120 ℃烘干法；霉菌总数：GB47.15-2010，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，计数单位为cfu/g(以干重计)；多酚氧化酶酶活：邻苯二酚比色法[10]，酶活单位为u/g(以干重计)；果胶酶和纤维素酶酶活：3、5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[11~12]，酶活单位为μg/(g·min)(以干重计)；

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表2 不同工艺条件下普洱茶渥堆过程霉菌和酶活变化

2013, Vol.29, No.3

Table 2 Time courses of mould and enzyme activities during pile-fermentation for Pu-erh tea by different process conditions 实验号 水平号 晒青茶 1

渥堆天数/d 8 16 24 8

2

223

16 24 8

3

313

16 24 4 8

4

111

12 16 20 24 4 8

5

231

12 16 20 24 4 8

6

321

12 16 20 24 6 7 122 12 18 24 6 8

212

12 18 24 6

9

332

12 18 24

注：ND表示未检出。

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堆表

霉菌

堆芯

多酚氧化酶 堆表

堆芯

纤维素酶 堆表

26±8 17±3 240±40 132±58 39±4 7±96 104±25 71±13 419±29 32±16 228±13 509±29 597±35 215±81 41±10 442±13 815±59 145±30 67±6 40±13 578±98 90±7 ND 22±6

16±5 堆芯

果胶酶 堆表

堆芯

133

(5.4±0.5)×102

(2.6±0.3)×108 (2.8±0.2)×106 (1.0±0.1)×108 (1.5±0.3)×107 (4.9±1.3)×108 (6.2±0.5)×106 (4.3±0.4)×108 (4.4±0.4)×107 (9.1±0.2)×106 (2.6±0.1)×106 (3.6±1.6)×107 (1.4±0.1)×107 (1.5±0.4)×107 (2.2±0.2)×108 (1.3±0.3)×106 (7.2±1.1)×105 (4.5±0.1)×107 (1.7±0.4)×106 (5.7±0.5)×106 (2.7±0.3)×106 (3.9±0.2)×106 (3.4±0.3)×106

0.28±0.08 0.83±0.03 0.48±0.16 9.65±0.49 1.18±0.06 3.18±0.97 1.21±0.13 5.55±0.88 2.±0.33 2.60±0.27 0.74±0.27

1.65±0.43 0.21±0.03 0.32±0.12 2.40±0.63 1.46±0.17 0.49±0.11 2.71±0.16 0.32±0.09 3.18±0.48 0.93±0.09 1±27 62±3

21±13 122±46 83±13 16±1 597±36 84±17 74±11 252±29 251±19 270±20 1029±22 487±26 3±27 346±26 343±33 427±12 761±29 833±33 447±32 2±27 167±55 2±25 157±39 332±9 28±1 61±12 427±24 1016±139 1095±213 4±5 1026±62 694±58 333±80 755±30 1692±21 616±35 ND

61±28 300±23 186±87 167±23 71±6

114±8

586±57 550±76 106±29 156±21 37±15 52±21 85±11 71±3 245±21 295±7 286±24 215±24

(3.0±1.0)×107 (1.0±0.2)×107 12.85±0.67 2.23±0.36

(5.1±0.6)×107 (1.6±0.5)×106 13.51±0.40 0.42±0.09 359±82 379±68 774±51 445±53 30±8 123±16 204±24 248±20 124±30 39±3 38±5 8±2

131±9 980±90 862±132 888±20 1±59

0.97±0. 10.52±0.50 815±129 147±21 275±47

(4.8±0.1)×106 (2.2±0.8)×106 12.14±2.19 5.13±0. (2.1±0.5)×106 (8.3±2.7)×105 16.27±0.16 3.45±0.12 (8.3±1.4)×107 (4.5±0.6)×106 (3.1±0.3)×107 (5.3±0.2)×106 (1.3±0.2)×107 (2.6±0.6)×106 (7.8±0.4)×106 (7.5±1.5)×105 (5.5±1.0)×106 (1.5±0.4)×106 (8.1±1.4)×105 (9.7±2.3)×105 (9.4±1.7)×106 (3.8±0.1)×106 (6.7±0.3)×106 (1.7±0.1)×105 (1.1±0.2)×106

ND (1.7±0.1)×105

ND ND ND ND ND

7.60±0.25 3.18±0.58 1.07±0.31 9.42±0.50 3.85±0.59 1.36±0.57 4.52±0.34 2.48±0.32 0.79±0.35 0.85±0.34 0.±0.11 0.62±0.21 0.49±0.24 7.84±0.46 1.39±0.17 4.15±0.44 1.13±0.20

6.60±1.30 7.11±0.97 0.61±0.17 4.03±0.72 3.±0.21 1.77±0.16 1.22±0.38 7.94±1.61 2.10±0.41 0.65±0.18 0.61±0.23 0.74±0.20 0.23±0.02 7.90±0.35 1.42±0.21 0.47±0.08 5.80±1.05

1092±159 187±4

129±16 361±53

427±134 271±70 580±11

212±44 847±63 45±9 7±1 30±11

333±48 31±5 602±15

267±109 129±34 433±101

(3.7±0.2)×107 (1.8±0.6)×106 (4.0±1.0)×106 (4.2±0.2)×106 (2.9±0.8)×107 (3.3±0.1)×107 (1.0±0.2)×106 (2.8±0.5)×106 (1.1±0.2)×107 (3.6±0.3)×106 (4.0±0.5)×107 (2.5±0.5)×106 (2.4±0.1)×107 (1.1±0.1)×106 (2.1±0.2)×106 (4.8±0.8)×106 (1.2±0.2)×107 (4.0±0.5)×106

8.38±0.68 10.80±0.41 936±102 439±98 669±53 660±63 249±23

3±55 755±60 260±50 404±52

1088±133 50±19 1071±71 1365±158

(1.1±0.2)×107 (1.7±0.2)×107 12.±0.34 8.47±0.82 (2.3±0.1)×107 (6.6±0.1)×105 17.55±2.23 9.32±1.11

666±106 586±191 744±185 2±117 501±17 901±80 26±9 49±12 1142±211 1394±174 506±67 803±150 767±71 424±14 80±11

345±95 15±27 329±78 0±127 37±10 32±11

1114±43 320±40 1499±222 1527±37

(2.2±0.6)×107 (2.0±0.3)×106 12.48±0.83 1.17±0.30

9.75±0.27 1.05±0.21 0.42±0.12

1.±0.40 0.73±0.13 0.60±0.30

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 表3 普洱茶渥堆工艺因素试验结果

Table 3 Factor test results of pile-fermentation process for Puerh tea

2013, Vol.29, No.3

实验号 水平号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 133 223 313 111 231 321 122 212 332 茶多 酚/% 7.92 6.16 1.97 6.95 6.14 1.62 8.2 6.51 3.91 儿茶素 茶褐素 /(mg/g) 34.43 8.58 4.47 15.08 5.01 1.13 16.53 9. 3.05 /% 15.65 20.66 15.3 14.34 18.12 2. 12.12 14.13 13.07 霉菌 峰值

均值

多酚氧化酶 峰值 均值 9.65 5.55 9.42 7.94 2.19 2.15 4.18 1.92 纤维素酶 果胶酶

均值 126 253 185 383 555 341 8 983 750 峰值 均值 240 7 419 815 1092 578 1088 1114 1394 109 301 150 334 261 173 509 441 485 峰值 300 597 252 980 847 4.9×108 1.5×108 2.2×108 4.8×107 8.3×107 1.3×107 9.4×106 1.8×106 4.3×108 8.8×107 12.85 3.88 5.1×107 1.0×107 16.27 5.82

1029

3.7×107 1.7×107 12. 7.09 4.0×107 1.1×107 17.55 5.15 2.4×107 9.0×106 12.48 3.51 1365 1527 1692 注：对表3结果进行极差分析，结果见表4。 对表3结果进行方差分析，普洱茶高级氧化产物茶褐素含量和被氧化物茶多酚、儿茶素总量与初始水分含量、初始pH值和翻堆间隔各因素之间F值均A>B>空白 C>A＞B>空白 C>空白>A>B C>A>空白>B C>空白>A>B C>空白>A>B C>空白>A>B C>A>空白>B C>A>空白>B A>C>B>空白 A>C>空白>B 工艺组合 C3A2B3 C3A1B3 C2A2B1 C2A1B1 C2A2B3 C2A2B1 C2A2B3 C2A2B1 C3A2B3 A3C1B1 A3C1B2 活性显著高于其他组(30%、40%和45%)[14]。尽管在微酸环境(pH=5.0)下有利于增强多酚氧化酶，但是调整初始pH值的作用对其微乎其微。 对纤维素酶酶活峰值和均值影响的主次关系为C>空白>A>B，说明主要影响因素是翻堆间隔，在翻堆间隔为6 d条件下酶活性最强。其次是空白未知因素，初始水分含量在45%时有利于纤维素酶，初始pH值的影响最弱忽略不计。 同纤维素酶一样，对果胶酶酶活峰值和均值主要影响因素是翻堆间隔，在翻堆间隔为6 d条件下酶活性最强。初始水分含量对渥堆过程中酶活峰值的影响弱于空白未知因素，但是45%的初始水分有利于提高渥堆过程整体强度。 对普洱茶高级氧化产物茶褐素含量和被氧化物茶多酚、儿茶素总量进行分析，说明了初始水分含量过高(50%)、翻堆间隔频率过高或过低(4 d、8 d)会引起普洱茶氧化过度，导致其品质下降。 3 结论 3.1 渥堆过程中，初期霉菌大量生长，随后数量趋于稳定。多酚氧化酶活性呈现增-减-增、先增后减和增-减-增-减3种变化趋势，纤维素酶和果胶酶酶活性呈现先增后减的S型曲线变化趋势，仅酶活性峰值大小和出现时间不同。 3.2 选择合适的初始水分含量能使茶胚渥堆过程中霉菌和各类酶活性维持在较高水平，调整茶胚的初始pH值对微生物和酶活的影响不显著可以忽略不计，翻堆间隔在8 d有利于茶胚霉菌保持在高水平，翻堆间隔在6 d有利于酶活保持在高水平。以茶褐素含量、茶多酚和儿茶素总量作为普洱茶氧化程度的指标，表明初始水分含量过高、翻堆间隔频率过高或过低会引

多酚氧化酶 纤维素酶 果胶酶 茶褐素 茶多酚 儿茶素 对霉菌数峰值和均值影响的主次关系为C>A>B>空白，说明适当延长翻堆间隔（8 d）、初始水分含量40~45%、不调整pH值有利于渥堆过程中霉菌生长繁殖。

对多酚氧化酶酶活峰值和均值主要影响因素是翻堆间隔，在翻堆间隔为6 d条件下酶活性维持在最高水平。其次是初始水分含量和空白未知因素，初始水分为45%有利于多酚氧化酶峰值提前出现，但适当降低水分含量有利于提高渥堆过程整体酶活强度。有研究表明在初始水分含量在35%的条件下，多酚氧化酶

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起普洱茶氧化过度，导致其品质下降。因此，选择合适的工艺条件有利于普洱茶品质提高。

3.3 影响霉菌生长、胞外酶分泌的因素有很多，除了茶叶本身的营养物质，还有许多物理化学因素，如外界环境的温度、湿度、茶胚水分含量、pH值、氧气和渗透压。本实验采用模拟自然发酵的方式进行渥堆，只对初始水分含量、pH值以及翻堆间隔进行量化分析，没有对其它指标进行量化，导致实验分析中空白未知因素对结果影响较大，说明渥堆过程受外界环境因素影响较大。

3.4 由于渥堆过程中取样次数较少，只能表示其变化趋势而不能清楚反应各指标的细微变化，数据太少无法准确地分析微生物-酶-内含物质之间相互关系。 3.5 本实验通过小批量模拟自然渥堆研究工艺条件对微生物及酶活的影响，可以在此基础上，通过选择合适的微生物菌剂、外源酶制剂，进一步探讨对普洱茶品质的影响，为普洱茶发酵工艺的控制和改进提供一定的理论依据。 参考文献

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