第３７卷第４期 ２０１５年４月 中国预防兽医学报 ＶＯｌ＿３７．ＮＯ．４ Ａｐｒ．２０１５ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．３９６９ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１５．０４．１１ 牛传染性鼻气管炎病毒ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ 荧光定量ＰＣＲ方法的建立 乔波，陈楠楠，赵静虎，王华欣，朱战波 （黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆１６３３ １９） 摘 要：为建立牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）的ＴａｑＭａｎ荧光定量ＰＣＲ检测方法，本研究根据ＩＢＲＶ ｇＢ基 因保守区域设计特异性引物和ＭＧＢ探针，并采用矩阵法优化了ＰＣＲ反应条件。结果显示，标准曲线相关系数 （Ｒ２）为０．９９８，１０。拷贝／ Ｌ～１０ 拷贝／ Ｌ内具有较好的线性关系。对牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻粘膜病ｌ 型、牛副流感病毒３型的ｃＤＮＡ进行检测，结果均为阴性，特异性良好。该方法对ＩＢＲＶ检测的灵敏度可达到 １．４９ｘ１０ 拷贝／ ，是常规ＰＣＲ灵敏度的１００倍，重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于１．５％。 应用建立的方法与普通ＰＣＲ方法分别对１７份疑似临床呼吸道症状牛鼻黏液拭子样品进行检测，该方法检测的阳 性率比传统ＰＣＲ法检测的阳性率提高了约１２％。研究表明建立的ＩＢＲＶ ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ荧光定量ＰＣＲ方法灵敏、 快速、特异性强、重复性好，适用于临床疑似样品的快速定量检测。 关键词：ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ探针；荧光定量ＰＣＲ；牛传染性鼻气管炎 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８．０５８９（２０１５）０４．０２８２．０４ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＴａｑＭａｎ—－ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ ｒｅａｌ－－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎＯｔｒａＣｈｅｉｔｉＳ ｖｉｒｕｓ Ｑ［ＡＯ Ｂｏ，ＣＨＥＮ Ｎａｎ－ｎａｎ，ＺＨＡＯ Ｊｉｎｇ－ｈｕ，ＷＡＮＧ Ｈｕａ—ｘｉｎ，ＺＨＵ Ｚｈａｎ—ｂｏ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｎｅｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ １６３３１９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＩＢＲＶ），ｔｈｅ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＩＢＲＶ ｇｎ ｇｅｎｅ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓｓａｙ ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ａ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ａｎｄ Ｃｔ ｖａｌｕｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｆ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｅ ｗａｓ ０．９９８．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ＩＢＲＶ．ｂｕｔ ｎｏ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｕｓ，ｂｏｖｉｒｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｌｉｍｉｔ ｏｆｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ １．４９ｘ１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｌ￣Ｌ ｏｆｉｎｉｔｉａｌ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ １００一ｆｏｌｄ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ．Ｍｏｒｅｖｅｒ．ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ａ ｃｏｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １．５％ｆｏｒ ｂｏｔｈ ｉｎｔｒａ—ａｎｄ ｉｎｔｅｒ—ａｓｓａｙｓ．Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ，ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗａｓ １ ２％ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃ ｆｏｒ ＩＢＲＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＴａｑＭａｎ－－ＭＧＢ ｐｒｏｂｅ；ｒｅａｌ－－ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ 收稿日期：２０１４．０９．１２ ３） 基金项目：省科技厅科技项目（ＧＣ１２Ｂ７１３）； “十二五”科技部项目（２０１２ＢＡＤ１２Ｂ０３—硕士研究生，主要从事牛呼吸道传染病的流行病学和免疫 作者简介：乔波（１９８９一），男，河南商丘人， 防治技术研究． 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｂｏｚｈｕ＠１６３．ｃｏｍ 第４期 乔波，等．牛传染性鼻气管炎病毒ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ荧光定量ＰＣＲ方法的建立 ２８３ 牛传染性鼻气管炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａｃ． ｈｅｉｔｉｓ，ＩＢＲ）是由ＩＢＲ病毒（ＩＢＲＶ）引起的一种急性、 热性、接触性传染病，主要表现为高热、呼吸困 用ＯＭＥＧＡ胶回收试剂盒回收，克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载 体中，对重组质粒进行测序。使用核酸．蛋白定量 检测仪测定质粒浓度，按照公式：拷贝数＝（质量／ 分子量）ｘ６．０ｘ１０ 计算标准品的拷贝数。将制备的 标准品按１０倍梯度稀释后，作为标准品冻存。 表１ 引物和探针序列 难、鼻炎和母畜流产等疾病…。１９５６年Ｍａｄｉｎ等首 次从病牛体内分离到该病毒［２】，我国１９８０年从新西 兰进口的奶牛中首次分离到该病毒【３］。该病虽然死 亡率低，但严重影响牛的生长、产奶量和国际贸易［４］。 ＯＩＥ规定检测该病毒的常规方法是采用细胞分 离病毒，血清中和试验和ＥＬＩＳＡ，但这些方法在灵 敏度、时间和成本上均存在问题。荧光定量ＰＣＲ检 测方法比常规方法灵敏性高，更具时效性［５］。小沟 结合物（Ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ，ＭＧＢ）探针的３’端包括 两个亚基：淬灭￣１］（ＮＦＱ）的ＭＧＢ，ＭＧＢ增加了探 针的解链温度，这就使得探针的长度更短特异性更 强［６］，两者结合的ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ探针荧光定量ＰＣＲ 驸 Ｆ Ｒ 为ＩＢＲＶ的早期诊断和定量检测提供可靠的方法。 目前还未见采用ＴａｑＭａｎ．ＭＧＢ探针荧光定量ＰＣＲ 方法检测ＩＢＲＶ的报道，本研究建立了该方法，为 有效防制ＩＢＲ提供了有益的尝试。 １ 材料和方法 １．１病毒株ＩＢＲＶ Ｂａｒｔｈａ－Ｎｕ／６７株、牛病毒性腹泻 粘膜病病毒（Ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ＢＶＤＶ）、牛 呼吸道合胞体病毒（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ， ＢＲＳＶ）、牛副流感病毒一３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３，ＢＰＩＶ．３）均由本实验室保存。 １．２主要试剂ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合 酶、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、大肠杆菌感受态 ＤＨ５．Ｏｔ、ｐＭＤ１８．Ｔ载体均购自ＴａＫａＲａ公司；胶回 收试剂盒、ＤＮＡ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ提取试剂盒购自 ＯＭＥＧＡ公司。 １．３ 引物和探针设计 参照ＩＢＲＶ Ｂａａｈａ．Ｎｕ／６７株 的全序列（ＮＣ ００１８４７．１），采用ＤＮＡＳｔａｒ软件分析 ＮＣＢＩ中其它ＩＢＲＶ的不同病毒株全序列，选取ｇＢ 基因中的特异性保守序列设计引物和探针，引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成，预计扩 增片段的长度为１４８ ｂｐ。ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ探针５’端荧 光基团为ＦＡＭ，３’端荧光淬灭基团为ＭＧＢ，探针 由上海基康生物技术有限公司合成（表１）。 １．４标准品的制备按照ＯＭＥＧＡ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ提取 试剂盒说明书提取ＩＢＲＶ的ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后使 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｌｉｌｅｒ８ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｏｆｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５＇－３’）Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｓｔｒａｎｄ ＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＴＴＴＡＴＴ ５７７８４．５７８０２ Ｓｅｎｓｅ ＣＧＴＧＧＴＧＡＴＣＧＧＧＴＡＣＡＧＣ ５７９１３－５７９３ｌ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＦＡＭ—ＦＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＡＡ－ＭＧＢ ５７８８６—５７９００ Ｓｅｎｓｅ １．５标准曲线的建立 １．５．１ 荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化利用ＰＣＲ 仪上的温度梯度功能，在５５℃～６５℃退火温度下 进行检测，选择最佳退火温度。参照试剂盒中２０ Ｌ 反应体系要求，以１０ 拷贝／ Ｌ～１０ 拷贝／ＩｘＬ的重 组质粒为模板，进行荧光定量ＰＣＲ反应，设计以相 同浓度重组质粒为模板，采用不同浓度的引物和探 针，采用矩阵法优化最适合反应的引物及探针浓 度。在相同模板浓度条件下，采用矩阵法优化引物 和探针浓度，以ｃｔ值最小，荧光强度增加值最大， 两者不一致优先考虑ｃｔ值为原则进行条件优化。 １．５．２标准曲线的绘制将重组质粒标准品倍比稀 释为１０ 拷贝／ＩｘＬ～１０。拷贝／ Ｌ，根据最优化的反 应条件进行扩增，使用ＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＭＴ仪自带的 软件进行分析，生成标准曲线及方程，并计算相关 系数。 １．６特异性试验提取ＢＰＩＶ ３、ＢＶＤＶ．１、ＢＲＳＶ 的ＲＮＡ，并进行反转录制备ｃＤＮＡ和ＩＢＲＶ的ＤＮＡ 作为模板，利用已经建立的荧光定量ＰＣＲ方法进行 检测，并设置阴性对照。 １．７灵敏性试验 以１０倍系列稀释的重组质粒 （１０ 拷贝／ ～１０ 拷贝／ ）为模板，进行荧光定量 ＰＣＲ确定最小检出量，同时进行普通ＰＣＲ反应，比 较两者的灵敏性。 １．８重复性试验 １Ｏ倍比稀释（１０ 拷贝／ｔｘＬ～１０。 拷贝／ Ｌ）得到７个浓度标准品，分别进行批内和批 间重复性试验，测定该方法的稳定性。 １．９临床样品检测对２０１４年上半年黑龙江大庆 地区不同养殖场有呼吸道症状的ｌ７份牛的肺脏样 品分别采用荧光定量ＰＣＲ、常规ＰＣＲ和病毒分离进 行检测。
