第37卷第4期 2015年4月 中国预防兽医学报 VOl_37.NO.4 Apr.2015 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine doi:10.3969j.issn.1008-0589.2015.04.11 牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan—MGB 荧光定量PCR方法的建立 乔波,陈楠楠,赵静虎,王华欣,朱战波 (黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆1633 19) 摘 要:为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据IBRV gB基 因保守区域设计特异性引物和MGB探针,并采用矩阵法优化了PCR反应条件。结果显示,标准曲线相关系数 (R2)为0.998,10。拷贝/ L~10 拷贝/ L内具有较好的线性关系。对牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻粘膜病l 型、牛副流感病毒3型的cDNA进行检测,结果均为阴性,特异性良好。该方法对IBRV检测的灵敏度可达到 1.49x10 拷贝/ ,是常规PCR灵敏度的100倍,重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%。 应用建立的方法与普通PCR方法分别对17份疑似临床呼吸道症状牛鼻黏液拭子样品进行检测,该方法检测的阳 性率比传统PCR法检测的阳性率提高了约12%。研究表明建立的IBRV TaqMan.MGB荧光定量PCR方法灵敏、 快速、特异性强、重复性好,适用于临床疑似样品的快速定量检测。 关键词:TaqMan.MGB探针;荧光定量PCR;牛传染性鼻气管炎 中图分类号:¥852.65 文献标识码:A 文章编号:1008.0589(2015)04.0282.04 Development of TaqMan—-MGB probe real--time PCR for detection of infectious bovine rhinOtraCheitiS virus Q[AO Bo,CHEN Nan-nan,ZHAO Jing-hu,WANG Hua—xin,ZHU Zhan—bo (College of Animal Scinece and Technology,Heilongiiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China) Abstract:To establish a sensitive detection protocol of infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV),the TaqMan real-time PCR was developed with a pair of primers and MGB probe targeting the conserved region of IBRV gn gene.With the optimized reaction conditions,the established assay possessed a linear relationship between initial templates and Ct value,and the correlation of the correlation coeficientf of the standard cure was 0.998.The assay was highly specific for ampliifcation from IBRV.but no ampliifcation from bovine viral diarrhea vius,bovirne respiratory syncytial virus,bovine parainfluenza virus type 3.In addition,the detected limit ofmethod was 1.49x10 copies/l ̄L ofinitial templates,which was 100一fold more sensitive than that ofconventional PCR.Morever.the method was highly reproducible and a coeficifent of variation was less than 1.5%for both intra—and inter—assays.Seventeen clinical samples were tested by the real—time PCR comparing with conventional PCR,and positive rates was 1 2%higher than the PCR assay.These data suggested that the developed real—time PCR assay was potentially applied in laboratory and clinic for IBRV detections. Key words:TaqMan--MGB probe;real--time PCR;infectious bovine rhinotracheitis *Corresponding author 收稿日期:2014.09.12 3) 基金项目:省科技厅科技项目(GC12B713); “十二五”科技部项目(2012BAD12B03—硕士研究生,主要从事牛呼吸道传染病的流行病学和免疫 作者简介:乔波(1989一),男,河南商丘人, 防治技术研究. 通信作者:E—mail:zhanbozhu@163.com 第4期 乔波,等.牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan.MGB荧光定量PCR方法的建立 283 牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotrac. heitis,IBR)是由IBR病毒(IBRV)引起的一种急性、 热性、接触性传染病,主要表现为高热、呼吸困 用OMEGA胶回收试剂盒回收,克隆至pMD18-T载 体中,对重组质粒进行测序。使用核酸.蛋白定量 检测仪测定质粒浓度,按照公式:拷贝数=(质量/ 分子量)x6.0x10 计算标准品的拷贝数。将制备的 标准品按10倍梯度稀释后,作为标准品冻存。 表1 引物和探针序列 难、鼻炎和母畜流产等疾病…。1956年Madin等首 次从病牛体内分离到该病毒[2】,我国1980年从新西 兰进口的奶牛中首次分离到该病毒【3]。该病虽然死 亡率低,但严重影响牛的生长、产奶量和国际贸易[4]。 OIE规定检测该病毒的常规方法是采用细胞分 离病毒,血清中和试验和ELISA,但这些方法在灵 敏度、时间和成本上均存在问题。荧光定量PCR检 测方法比常规方法灵敏性高,更具时效性[5]。小沟 结合物(Minor groove binder,MGB)探针的3’端包括 两个亚基:淬灭 ̄1](NFQ)的MGB,MGB增加了探 针的解链温度,这就使得探针的长度更短特异性更 强[6],两者结合的TaqMan.MGB探针荧光定量PCR 驸 F R 为IBRV的早期诊断和定量检测提供可靠的方法。 目前还未见采用TaqMan.MGB探针荧光定量PCR 方法检测IBRV的报道,本研究建立了该方法,为 有效防制IBR提供了有益的尝试。 1 材料和方法 1.1病毒株IBRV Bartha-Nu/67株、牛病毒性腹泻 粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛 呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒一3(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV.3)均由本实验室保存。 1.2主要试剂DNA Marker、Ex Taq DNA聚合 酶、Premix Ex Taq DNA聚合酶、大肠杆菌感受态 DH5.Ot、pMD18.T载体均购自TaKaRa公司;胶回 收试剂盒、DNA Viral DNA提取试剂盒购自 OMEGA公司。 1.3 引物和探针设计 参照IBRV Baaha.Nu/67株 的全序列(NC 001847.1),采用DNAStar软件分析 NCBI中其它IBRV的不同病毒株全序列,选取gB 基因中的特异性保守序列设计引物和探针,引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成,预计扩 增片段的长度为148 bp。TaqMan—MGB探针5’端荧 光基团为FAM,3’端荧光淬灭基团为MGB,探针 由上海基康生物技术有限公司合成(表1)。 1.4标准品的制备按照OMEGA Viral DNA提取 试剂盒说明书提取IBRV的DNA,经PCR扩增后使 Table 1 Prililer8 and TaqMan probe ofreal-time PCR Target gene Sequence(5'-3’)Position Strand GGGCATCGCCTCGTTTATT 57784.57802 Sense CGTGGTGATCGGGTACAGC 57913-5793l Antisense FAM—FCCGCCTCCGCAGCAA-MGB 57886—57900 Sense 1.5标准曲线的建立 1.5.1 荧光定量PCR反应条件的优化利用PCR 仪上的温度梯度功能,在55℃~65℃退火温度下 进行检测,选择最佳退火温度。参照试剂盒中20 L 反应体系要求,以10 拷贝/ L~10 拷贝/IxL的重 组质粒为模板,进行荧光定量PCR反应,设计以相 同浓度重组质粒为模板,采用不同浓度的引物和探 针,采用矩阵法优化最适合反应的引物及探针浓 度。在相同模板浓度条件下,采用矩阵法优化引物 和探针浓度,以ct值最小,荧光强度增加值最大, 两者不一致优先考虑ct值为原则进行条件优化。 1.5.2标准曲线的绘制将重组质粒标准品倍比稀 释为10 拷贝/IxL~10。拷贝/ L,根据最优化的反 应条件进行扩增,使用ABI StepOnePlusMT仪自带的 软件进行分析,生成标准曲线及方程,并计算相关 系数。 1.6特异性试验提取BPIV 3、BVDV.1、BRSV 的RNA,并进行反转录制备cDNA和IBRV的DNA 作为模板,利用已经建立的荧光定量PCR方法进行 检测,并设置阴性对照。 1.7灵敏性试验 以10倍系列稀释的重组质粒 (10 拷贝/ ~10 拷贝/ )为模板,进行荧光定量 PCR确定最小检出量,同时进行普通PCR反应,比 较两者的灵敏性。 1.8重复性试验 1O倍比稀释(10 拷贝/txL~10。 拷贝/ L)得到7个浓度标准品,分别进行批内和批 间重复性试验,测定该方法的稳定性。 1.9临床样品检测对2014年上半年黑龙江大庆 地区不同养殖场有呼吸道症状的l7份牛的肺脏样 品分别采用荧光定量PCR、常规PCR和病毒分离进 行检测。