图片提供／ｋａｒ ｎ Ｈｅｒｚｏｇ 全丝胶蚕品种丝 胶蛋白酶的抗氧化能力 文／陈复生 绿ｓ 全天然黄绿色丝胶品种 白ｓ 全天然白丝胶品种 ＹＺ０１远缘杂交黄绿色普通品 种 ＹＺ０２远缘杂交白色普通品种 ＪＳ 菁松皓月现行普通品种 均由安徽省农业科学院蚕 桑研究所提供。 ２实验方法 ２．１丝胶溶解 称量供试品种蚕茧各５ ｇ， 用温水洗涤去掉赃物，剪成碎 片，加入用氢氧化钠调ＰＨ至 １０．５的溶液２５０ ｍ１，浸泡一小 时，加入ｌ０ ｇ碳酸钠／１００ ｍｌ， 放入灭菌锅在ｌ２５ ｏＣ煮２．５ ｈ， 用纱布过滤，生丝用温水洗涤 三遍，合并蚕丝脱胶液和洗涤 液，然后滤纸抽滤，获得丝胶 溶液。 ２．２丝胶溶液浓缩 丝胶溶液在８０￣Ｃ旋转蒸发至 约２００ ｍｌ，浓缩液￣ｎＡ．４ｏｏ ｍ１９５％ 的乙醇，摇匀，在６０００ ｒ／ｍｉｎ分离 心１０ ｍｉｎ，弃去上清，留下沉淀。 ２．３冷冻真空干燥 分别在试管中加入２０ ｍ１ 丝胶浓缩液置于离心管中， 往其中慢慢滴入０．１ ｍｏｌ／１的盐 酸溶液，至溶液中有浑浊， 放入在冷冻真空干燥仪在样 品温度一３ ３℃，压强１帕斯卡 条件下干燥。 满仓 ３丝胶蛋白酶解物的抗氧化性 ３．１抗氧化性实验原理 清除羟基自由基：双氧水在亚铁离子的催化 下会反应生成羟基自由基，生成羟基自由基过程 中，５３６ ｎｍ￣１３５１０ｎｍ处有光吸收的中间产物，当 加入超氧自由基清除剂时，能迅速与超氧自由基 反应，阻止中间产物的积累，致使溶液在３２０ ｎｍ 处吸收减弱，以水杨酸乙醇溶液作为捕捉剂，生 成紫色，在波长５ １０ ｎｍ￣Ｄ５３６ ｎｍ检测吸光度［１４］ Ａ３为无显色剂时的该浓度的本底值。 ３．４清除超氧自由基的能力 取０．０５ ｍｏｌ／１ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液（ｐＨ＝８．２）４ ｍｌ， 置于２５℃水浴中预热２０ｍｉｎ，分别加入待测液０．５ ｍ１￣１３２５ ｍｍｏｌ／１邻苯三酚溶液０．５ ｍｌ，混匀后于 ２５℃水浴中反应５ ｍｉｎ，加入８％的ＨＣ１ ０．２ ｍｌ终 止反应，在３２０ ｎｍ处测吸光度，取约０．１ｇ丝胶蛋 白溶于水作为样品溶液，以０．５ ｍｌ蒸馏水作空白代 替待测液作空白试验，于５３６ ｉｌｍ处测吸光值。 清除率（％）＝【Ａ３一（Ａ１一Ａ２）】／Ａ３ｘｌ００ 来评价清除剂对羟基自由基的清除作用。 清除超氧自由基（・０２一）：采用邻苯三酚自氧化 法产生超氧自由基，邻苯三酚在ｐＨ＞７．９后迅速自 氧化。自氧化过程中形成一系列３２０ ｎｍ处有光吸 式中：Ａ１对照不加样品； Ａ２底物浓度时的吸光值； Ａ３无显色剂时的该浓度的本底值。 收的中间产物，当加入超氧自由基清除剂时，能 迅速与超氧自由基反应，阻止中间产物的积累， 致使溶液在３２０ ｎｍ处吸收减弱。通过测定吸光度 ３．５丝胶蛋白酶解物的抗氧化能力 丝胶蛋白酶解在试管中加入０．１ｇ／ｍｌ风味酶 ２ｕｌ、０．１ｇ／１丝胶溶液、ＰＨ７．０、液温５０℃的条件下 进行酶解反应２ｈ后，１００℃水煮１０ ｍｉｎ对酶的灭活 值加值来评价清除剂对超氧自由基的清除作用。 ３．２试齐怕勺配制 ０．０５ ｍｏｌｌ１ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲液（ｐＨ ８．２）：准确 称量Ｔｒｉｓ：６．０５７ ｇ，加入９９０ ｍＬ蒸馏水，混匀， 使得Ｔｒｉｓ溶解，用１ ｍｏｌ／１ ＨＣ１调ＰＨ到８．２． 后对其样品溶液进行吸光值测定，并计算去除自由 基能力。 ＝ 结果与分析 １丝胶蛋白本身的去除羟基自由基能力 制备ｌｇ／１未经过酶解的丝胶蛋白溶液，设置３ 水杨酸乙醇溶液：准确称量水杨酸０．１４３ ｇ， 用无水乙醇定容到１００ ｍｌ，摇匀。 ３．３去除羟基自由基的实验方法 用ＦｅＳＯ４＋Ｈ２０２产生．０Ｈ，以＿０Ｈ氧化水杨酸 个重复区，在波长５３６ｎｍ处进行检测吸光度，按 照３．４的方法计算去除羟基自由基能力如表１。 钠所得产物的吸光值表示‘ｏＨ的多少，吸光值越 大，‘０Ｈ越多。反应试管中加入０．５ ｍｌ，９ ｍｍｏｌ／１ ＦｅＳＯ４、０．５ ｍｌ ９ ｍｍｏｌ／１水杨酸一乙醇及１ ｍｌ不同 浓度的样品，最后加９ ｍｍｏｌ／１ Ｈ２０２ ０．５ ｍｌ启动 反应，３７℃温浴１ ｈ，取约０．１ｇ丝胶蛋白溶于水作 为样品溶液，以０．５ ｍｌ蒸馏水作空白代替待测液作 空白试验，于５３６ ｎｍ［１５］处测吸光值。 清除率（％）＝［Ａ３一（Ａ１一Ａ２）］／Ａ３ｘｌ００ 式中：Ａ１为对照不加样品； 表１丝胶蛋白本身去除羟基自由基的能力 编号 １ Ａ１ ０．６６０３ Ａ２ ０．００３７ Ａ３ ０．６７３ 抗氧化性能力（％） ２．４３７ ２ ３ ０．６６０３ ０．６５９５ ０．００３９ ０．００３８ ０．６７２４ ０．６７２３ ２．３８０ ２．４６９ 从表１可以看出，丝胶蛋白本身的去除羟基自 Ａ２为某浓度时的吸光值； 由基的能力很差，几乎没有底物浓度的差别，最 设置０．０２—０．１０％的５个不同底物浓度，各 ３个重复区，在波长５３６ｎｍ处进行检测去 除羟基自由基吸光度，按照３．４的方法计 算去除羟基自由基能力，丝胶蛋白浓度 作为横坐标，去除羟基自由基的能力作 为纵坐标，得到图１及图２。 图１、图２显示同样的趋势，各种丝 胶的去除超氧自由基的能力不同，基本 上是全天然黄绿丝＞全天然白丝＞远缘 杂交＞远缘杂交白丝＞菁松皓月，随 着蛋白浓度在增加，去除超氧自由基的 能力也随之增加，绿ｓ的去除超氧自由基 能力最高可达Ｎ２５％以上，白Ｓ的去除超 氧自由基能力也可达到２０％以上。菁松 皓月仅在７％左右。 ３不同品种丝胶蛋白酶解物的去除超 高的仅为２．４６９％，几乎可以认为丝胶蛋 白本身没有抗氧化能力。 氧自由基的能力 取供试的５种丝胶蛋白，分别制备 １ ｇ／１经过风味酶解的丝胶酶解物，设置 ２不同蚕茧提取的丝胶蛋白的去除羟 ０．０２—０．１０％的５个不同底物浓度，各３个 基自由基的能力 取供试的５种丝胶蛋白，分别制备 ｌｇ／１经过风味酶解的丝胶酶解物０．１ｇ／ｌ， 重复区，在波长３２０ｎｍ处进行检测去 除超氧自由基的吸光度，并且计算去除 羟基自由基能力，丝胶蛋白浓度作为横 坐标，去除羟基自由基的能力作为纵坐 标，得到图３。 和图１、图２实验结果相近，各种丝 胶的去除超氧自由基的能力不同，基本 上是全天然黄绿丝＞全天然白丝＞远缘 杂交＞远缘杂交白丝＞菁松皓月，随 着蛋白浓度在增加，去除超氧自由基的 能力也随之增加，绿ｓ的去除超氧自由基 能力最高可达￣ｊ４ｏ％以上，白Ｓ的去除超 氧自由基能力也可达到２５％以上。菁松
