过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

2019年第2期3月JOURNALOFSUNYAT⁃SENUNIVERSITY（MEDICALSCIENCES）中山大学学报（医学版）

Vol.40

March2019No.2

DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2019.0030

过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

郑丹琴1，2，刘志磊3，朱松杰2，吕锦晶2，章文韵2，邓海腾3，周

3.清华大学生命科学学院，北京100038）

韧1

（1.浙江大学医学院病理学与病理生理学系，浙江杭州310058；2.杭州市临安区人民医院病理科，浙江杭州311300；

摘要：【目的】探讨肾透明细胞癌组织中硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3（PRDX3）的表达与肾透明细

胞癌发生发展的关系。【方法】本研究首先在16例肾透明细胞癌组织及癌旁组织中验证了PRDX3的表达。根据表达量构建了786-O的PRDX3过表达细胞系及敲低表达细胞系，考察了PRDX3过表达和敲低表达后，肿瘤细胞的生长情况。通过pull-down试验联合LC-MS/MS技术寻找PRDX3的相互作用蛋白。初步探究了PRDX3与过氧化物酶1（PRDX1）的相互作用关系及PRDX3参与肾透明细胞癌发生发展的机制。【结果】16例肾透明细胞癌组织样本的westernblot检测结果表明，有14例样本PRDX3下调表达，下调均值1.78倍左右。成功筛选到PRDX3过表达的786-O单克隆细胞系和对照细胞系［786O-PRDX（和786O-PRDX（］和PRDX3敲低表达的786-O单克3+）3-）隆细胞系和无意义序列对照细胞系（786O-PRDX3KN和786O-PRDX3NCi）。qPCR和westernblot结果表明，相比786O-PRDX（组，786O-PRDX（组在mRNA水平过表达约2.1倍，在蛋白水平过表达约1.8倍；相比786O-3-）3+）PRDX3NCi组，786O-PRDX3KN组在mRNA水平低表达约0.48倍，在蛋白水平低表达约0.51倍。CCK-8试验表明，相比786O-PRDX（），786O-PRDX（）细胞生长速率明显降低。但敲低PRDX3的表达后，敲低组和其对照组3-3+细胞的生长速率却无显著性差异。Pull-down试验发现PRDX3可能与PRDX1存在相互作用。结合质谱分析及数据库检索，发现PRDX3通过二硫键与PRDX1结合并发挥作用，分别通过plink软件鉴定到二者可信的结合位点，初步探讨了PRDX3参与肾透明细胞癌发生发展的可能机制。【结论】PRDX3在肾透明细胞癌组织中下调表达，可能参与了肿瘤的发生发展。提高PRDX3的表达水平，能显著降低肿瘤细胞的生长速率。基于PRDX3蛋白，可能开发针对肾透明细胞癌的靶向药物。

关键词：PRDX3；肾透明细胞癌；蛋白质相互作用；PRDX1

中图分类号：R34文献标志码：A文章编号：1672-35（2019）02-0211-08

MechanismofPRDX3InvolvedinDevelopmentandProgressionin

ClearCellRenalCellCarcinoma

2

ZHENGDan-qin1，，LIUZhi-lei3，ZHUSong-jie2，LÜJin-jing2，ZHANGWen-yun2，

DENGHai-teng3，ZHOURen1

2.DepartmentofPathology，People′sHospitalofLinan，Hangzhou311300，China；3.TsinghuaUniversity，SchoolofLife

Correspondenceto：ZHOURen；E-mail：zhouren@zju.edu.cn

Abstract：【Objective】ToinvestigatetherelationshipbetweentheexpressionofPRDX3（thioredoxin-dependent

（1.DepartmentofPathology&Pathopysiology，ZhejiangUniversity，SchoolofMedicine，Hangzhou310058，China；

Science，Beijing100038，China）

peroxidereductase）andtheoccurrenceanddevelopmentofccRCC（clearcellrenalcellcarcinoma）.【Methods】TheaccordingtothePRDX3over-expressionlevel，weestablishedthestablePRDX3overexpressioncelllinesandknockdown

expressionofPRDX3wasfirstverifiedin16casesofccRCCtissuesandadjacentnormaltissues.Inthepresentstudy，celllinesin786-Ocelllines.WedetectedthegrowthrateoftumorcellsafteroverexpressionandknockdownofPRDX3.

收稿日期：2018-09-13

基金项目：中国科技部国家高技术研究发展计划项目（2014AA020907）

作者简介：郑丹琴，在职研究生，医师，研究方向：病理学，E-mail：625001658@qq.com；周韧，通信作者，教授，博士生导师，研究方向：

病理学，E-mail：zhouren@zju.edu.cn

212中山大学学报（医学版）第40卷

InteractionproteinswithPRDX3weresearchedbyanti-flagpull-downtestcombinedwithLC-MS/MStechnique.The

interactionbetweenPRDX3andPRDX1（peroxiredoxin1）waspreliminarilyexplored.【Results】Thewesternblotresults

showedthatPRDX3weredown-regulatedin14outof16ccRCCtissuesamplesabout1.78times.StablePRDX3overex⁃pressionandknockdowncelllinesandthosecontrolgroupweresuccessfullyestablished［786O-PRDX3（+）and786O-PRDX3（-），786O-PRDX3KNand786O-PRDX3NCi］.PRDX3expressionin786O-PRDX3（+）was2.1timeshigher

than786O-PRDX3（-）atmRNAleveland1.8timesatproteinlevel.PRDX3expressionin786O-PRDX3KNwas0.48（+）celllineswassignificantlylowerthanthatof786O-PRDX3（-）.Meanwhile，therewasnosignificantdifferenceintimeslowerthan786O-PRDX3NCiatmRNAleveland0.51timesatproteinlevel.Thecellgrowthrateof786O-PRDX3786O-PRDX3KNandNCicelllines.Pull-downresultsshowsthatPRDX3mayinteractwithPRDX1throughdisulfidebondsioninrenalclearcellcarcinomaandtheinteractionwithPRDX1maybeinvolvedintheoccurrenceanddevelopmentoftumor.IncreasingtheexpressionlevelofPRDX3cansignificantlyreducethegrowthrateoftumorcells.BasedonPRDX3，itispossibletodeveloptargeteddrugsfortreatingrenalclearcellcarcinoma.

Keywords：PRDX3；clearcellrenalcellcarcinoma；proteininteraction；PRDX1

［JSUNYat⁃senUniv（MedSci），2019，40（2）：211-218］

andthebindingsitesofthosetwoproteinswereidentifiedrespectively.【Conclusion】PRDX3wasdown-regulatedexpres⁃

ccRCC）是泌尿系统常见的一种高度异质性恶性

［1］

肿瘤，是肾癌的主要类型（约80%）。手术切除

肾透明细胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma，系。发现过表达PRDX3的细胞系细胞生长明显变慢；但敲低表达PRDX3后，两组细胞生长速率在统计学上无显著性差异。提示提高PRDX3的表达量可能在某种程度上抑制了肿瘤细胞的生长。肿瘤的发生发展是一个多基因、多因素且多阶段的复杂过程。PRDX3参与肿瘤的发生发展过程，可能是与其他蛋白共同作用实现。本研究pull-down了与PRDX3相互作用的蛋白，发现过氧化物酶1（peroxiredoxin1，PRDX1）通过二硫键与响了肿瘤细胞的生长。

PRDX3相互作用。推测二者相互作用可能共同影

仍是目前较为常见的治疗手段［2］，但是肾透明细胞癌的特点是很容易转移，所以病人手术预后较差，死亡率较高［3］。目前缺乏ccRCC特异的肿瘤标志物，也缺少针对ccRCC的靶向药物。所以寻找ccRCC特异的肿瘤标志物，揭开肿瘤发生发展机制及找到相关的治疗靶点，仍是该领域的研究热点［4］。硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3（thioredoxin-dependentperoxidereductase3，PRDX3）是存在于线粒体中的过氧化物还原酶，线粒体DNA对于代谢产生的活性氧簇（ReactiveOxygenSpecies，ROS）更敏感，也更容易受到损伤。PRDX3能清除线粒体中90%的过氧化氢。目前已发现PRDX3在肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌等癌组织中高表达［5-8］，而在膀胱癌、肾癌、胰腺癌组织中下调表达［9］。PRDX3在不同的类型的肿瘤组织中表达量差异的原因，有待通过进一步研究揭示。本研究收集16例ccRCC癌及癌旁组织样本，发现其中14例ccRCC癌组织中PRDX3的表达量显著低于癌旁正常组织。推测PRDX3可能参与了肾透明细胞癌的发生发展过程，并且肾透明细胞癌中PRDX3的表达可能受到了抑制。本研究在786-O人肾透明细胞癌细胞系中过表达了PRDX3基因，使其表达量与正常组织表达量一致，也构建了PRDX3敲低表达的细胞

1

1.1

材料与方法

PRDX3抗体购自Abcam公司，兔源二抗购自材料与试剂

CellSignalingTechnology公司；内参β-actin抗体购Wisent公司、胎牛血清FBS购自四季青公司，双抗Dojindo公司；抗flagbeads购自sigma公司；qPCR合成；点突变试剂盒购自天根公司。1.2

实验仪器

自Abmart公司；人786-O细胞系、慢病毒质粒等来自本实验室保藏；使用RPMI10培养基购自青霉素/链霉素购自Sigma公司；CCK-8试剂购自试剂购自Vazyme公司；PCR引物由Invitrogen公司

仪（LC480，Roche），流式细胞分析仪（BDCalibur）。

QExactive质谱仪（Thermofisher），荧光定量PCR

第2期郑丹琴，等.过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

1.3

收集2015年5月至2016年3月期间在我院进

样本收集

213PRDX3基因的质粒和三种辅助质粒，通过慢病毒感染的方式，转入786-O细胞，使PRDX3基因插入细胞基因组中。用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，挑选单克隆，接种96孔板，两周内荧光显微镜观察，并将阳性克隆转移至6孔板扩大培养，根据表达量挑选合适的PRDX3过表达稳定细胞株。同时构建空载质粒的细胞系，标记为786O-PRDX3（+）和786O-PRDX（。同理，根据GenBank中3-）PRDX3的mRNA序列设计发卡结构和选取无意义shRNA序列（表1），构建PRDX3敲低表达细胞系和对照细胞系，标记为786O-PRDX3KN和786O-PRDX3NCi。

行肾切除术后的组织样本，术后病理结果证实为肾透明细胞癌的肾癌。癌和癌旁组织用PBS缓冲液冲洗后，一部分组织冻存于液氮中，另一部分用甲醛固定后用于免疫组化染色。患者术前均未经过放疗和化疗，本研究收集16例肾透明细胞癌及癌旁组织样本，患者年龄为48~72岁，其中男性理委员会的认可，并经患者同意。1.4

9例，女性7例。本项研究标本的收集均经本院伦

10培养基中培养人786-O细胞，将携带有

表1Table1

GenePRDX3NegativeControlshRNA-F（5′-3′）细胞培养与稳定表达细胞系构建

PRDX3及阴性对照的shRNA序列shRNAsequenceofPRDX3andcontrol

shRNA-R（5′-3′）TGAAGGCGTTCCAGTATGTAGAATTCAAGAGATTCTACATACTGGAACGCCTTTTTTTTCGACACGTTCGGAGAATTTTTTCTGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGT

TCGAGAAAAAAAAGGCGTTCCAGTATGTAGAATCTCTTGAATTCTACATACTGGAACGCCTTCAGAAACGTGACACGTTCGGAGAACATCGAGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTT

1.5

实时定量PCR和westernblot验证PRDX3的表

过表达和敲低表达细胞系的验证

后，加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗，室温孵育1h，再次洗膜，加入ECL显色液，用凝胶成像系统检测发光条带。肾透明细胞癌组织样品的westernblot试验操作同上，上样量为20μg。1.6

细胞生长曲线测定（CCK-8法）

达情况。qPCR特异性引物和β-actin内参引物见表2（http：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/），提取786O-PRDX（、786O-PRDX（、786O-PRDX33+）3-）逆转录成cDNA，配制qPCR反应体系，用Light每组实验的样品需同时做3个重复孔。

KN、786O-PRDX3NCi和野生型细胞的总RNA，Cycler®480II（Roche）进行实时荧光定量检测。SDS-PAGE，采用半干转三明治夹心法将蛋白从SDS-PAGE胶转到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1h，用PRDX3抗体（1∶500）4℃孵育过夜，洗膜

表2Table2

GenePRDX3β-actin

PRDX3KN、786O-PRDX3NCi和野生型5种细胞以每孔1000个细胞量均匀铺96孔板，时间梯度设置为12、24、48、60、72、96、108h，每个时间点每孔加入7μLCCK-8试剂，450nm处测定OD数值。每组设置3个重复孔和1个空白孔，本实验重复3次。以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

786O-PRDX3（+）、786O-PRDX3（-）、786O-

裂解上述五种细胞，取等量（10μg）蛋白上样

PRDX3及β-actin的qPCR引物qPCRprimersofPRDX3andβ-actin

CATGTACGTTGCTATCCAGGC

TGGACACCCGAGTCTCCTACForwardCACGGGACGGTCTACTGATTReverseCTCCTTAATGTCACGCACGAT

214中山大学学报（医学版）第40卷

1.7

flag的重组相互作用蛋白beadsPRDXpull-down试验3进行蛋白的pull-downC端融合有，寻找与flag标签，用抗

BCAPRDX3相互作用的蛋白。上述五种细胞系裂解，法测定蛋白浓度，按照5mg总蛋白用40μLbeads的比例，等质量等体积与beads孵育，4℃过夜孵育。裂解液冲洗beads3次后，加入等量的洗脱缓冲液，洗脱westernbeads上吸附的蛋白。进行SDS-PAGE电泳或将SDS-PAGEblot检测。

胶对应50ku左右的条带切下，

并进行脱色及酶切操作，用于二硫键鉴定的样品，全过程不使用DTT还原，质谱级胰蛋白酶溶液50∶1）37℃酶切过夜。萃取出酶切后的肽段，浓缩后进行1.8

Q质谱分析

LC-MS/MS质谱分析。data-Exactive质谱仪采用软件Xcalibur2.1.2以

Orbitrapdependent分辨率）中的全扫描范围为acquisition模后，母离子经32%的400式HCD~进1800行数据采集。能量值碎裂后，m/z（75，000进行20次二级MS/MS扫描。母离子选择的质量窗口为2.0m/z。触发MS/MS的阈值为8.0×103。动态排除时间为20s。质谱扫描产出的MS/MS谱图，通过使用ProteomeDiscoverer软件（version2.0）搜索1.9

uniprot同二硫键分析

人数据库（version20171220）。2.4准备样品，SDS-PAGE胶、细胞裂解液、

上样缓冲液均不含还原剂，样本处理方式分为与非PAGE变性，切胶、上样缓酶切与质谱鉴定。冲液混合直接上pLink样。软件搜索自

运行SDS-建数据库1.10

（PRDX1/PRDX3sequences统统计学分析

）。Pad计学分析采用SPSS软件（18.0）和Graph⁃

x±Prisms）表示。两组间数据比较采用5软件分析，计量数据以均数t检验，±标准差生长曲线各时间点的组间比较采用多时间点重复测量的

方差分析，本研究中试验均重复3次，P<0.05认为差异有统计学意义。

2

结果

2.1

在收集的肾透明细胞癌组织中16例肾透明细胞癌组织与对应的

PRDX3的表达验证

癌旁组织中检测了PRDX3的表达情况。图1A为

16值统计结果，例样本的western以癌旁组织表达量作为对照，blot检测结果，图1B为灰度进行归一化。16例肾癌样本中，有14例样品PRDX3下调表达，12白质组学的方法，例，下调均值为2例上调表达。其中差异1.781.35倍以上的有对16倍。此外，例肾癌及癌旁样本进行了本研究通过定量蛋定量分析，其中PRDX3的表达与westernblot结果基本一致，同样以下调1.35倍作为cutoff值，16例样本中有12例下调表达，下调均值为1.倍（表3）。

Anti-PRDX1N

1T

2N

2T

3N

3T

4N

4T

3Anti-actin

Anti-PRDX5N5T6N6T7N7T8N8T

3Anti-actin

Anti-PRDX9N9T10N10T11N11T12N12T

3Anti-actin

Anti-13N13T14N14T15N15T16N16T

Anti-PRDX3actin

A

3.02.5N

T

2.0oitaR1.51.00.50.0

1

2

34567

Samples

10111213141516

B

tissuesA：andWesternadjacentblottissueselectrophoreticpairs.；B：analysisNormalizationin16casesofccRCC

ccRCC，图N1

fornormal肿瘤组织样本中）

analysis（TforPRDX3的表达验证结果

Fig.1validationofPRDX3expressionintumortissues

2.2

本研究在PRDX3过表达和敲低表达细胞系的验证786-O细胞系中通过慢病毒表达载体感染细胞，qPCR隆细胞系中和western筛选多株单克隆稳转细胞系，采用1PRDXblot的方法验证了所挑选的单克3的表达情况。根据表达量挑选差异表达倍数接近株单克隆稳转细胞系，westernblot验证PRDX（1.78倍）使其表达量与组织水平。图2A、B为qPCR和3在mRNA和蛋白水平的过

（（第2期郑丹琴，等.过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

PRDX3的TMT定量蛋白质组学结果Ratio（N/T）1.772.112.1.52No.1011129Ratio（N/T）0.421.391.491.26No.13141516215表3

Table3

No.1234Ratio（N/T）1.471.451.182.43No.5678theratioresultsforPRDX3inquantitativeproteomicbasedonTMTlabeled

Ratio（N/T）1.482.340.562.32RelativemRNAexpressionlevelPRDX3/β⁃actinRelativemRNAexpressionlevelPRDX3/β⁃actin0.40.30.20.10.0

PRDX（）3-PRDX（）3+

0.200.150.100.050.00

NCi

KN

NCi及野生型细胞系（WT）进行了生长曲线测定。绘制OD值与时间的生长曲线。发现敲低PRDX3后，与阴性对照细胞相比，并无显著性差异（P=0.106；图3B）。2.4

Pull-down相互作用蛋白

本研究构建的786O-PRDX3（+）稳转细胞系

（-）

Anti-PRDX3Anti-β-actin

（+）

Anti-PRDX3Anti-β-actin

中融合了flag标签，采用Anti-flagtag的beads进行pull-down试验，用于与PRDX3相互作用蛋白的挑选。优先挑选与对照组相比，786O-PRDX（3+）

B

teinlevelsin786O-PRDX3（+）and786O-PRDX3（-），P=0.031，t=-3.83，n=3；B：qPCRandwesternblotanalysisofPRDX3mRNAandproteinlevelsin786O-PRDX3KNand786O-PRDX3NCi，P=0.002，t=-17.39，n=3，β-actinastheinternalreference.

A：qPCRandwesternblotanalysisofPRDX3mRNAandpro⁃

A

组特有的蛋白。表4呈现的是得分排在前10位的蛋白，这些蛋白主要与氧化应激与蛋白降解途径有关。

2.5PRDX3参与ccRCC发生发展机制的初步探索

研究表明，PRDX家族通过与其他蛋白形成

图2PRDX3过表达和敲低表达细胞系的验证结果VerificationforPRDX3mRNAandproteinexpressionindifferentcelllines

二硫键来传递氧化信号［10］，推测PRDX3也是通过二硫键与其他蛋白相互作用的。本研究利用二硫苏糖醇DTT和加热条件能打开二硫键的原理进行探索分析，图4为786O-PRDX（在还原/非还原3+）条件下pull-down的结果，PRDX3主带所在位置在26ku左右，PPI箭头处（48~63ku之间）出现明显相互作用蛋白。2.6

Fig.2

表达情况，与786O-PRDX（相比，786O-PRDX33-）（+）分别过表达约2.1倍和1.8倍。图2C、D为qP⁃的敲低表达情况，与786O-PRDX3NCi相比，786O-PRDX3KN分别低表达约0.48倍和0.51倍。2.3

细胞生长速率检测

CR和westernblot验证PRDX3在mRNA和蛋白水平

的特异性条带，推测可能是与PRDX3特异结合的

为了探究PRDX3的表达量对肾透明细胞癌细

胞生长的影响，本研究对786O-PRDX（）、786O-3+PRDX（及野生型细胞系（WT）进行了生长曲3-）线测定，绘制OD值与时间的生长曲线。786O-PRDX（）与786O-PRDX（）细胞系相比，48h后3+3-出现显著性差异，细胞生长速度显著减慢（P=他两组细胞下降了约30%（图3A）。

0.001）。至120h时，786O-PRDX（）组细胞较其3+

本研究也对786O-PRDX3-KN、786O-PRDX3-

PRDX1与PRDX3结合位点的初步确认

结合SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，将图4箭头对应条带切下，胶条经脱色等处理后，进行胰蛋白酶酶切，进行质谱分析，通过pLink软件将质谱谱图与数据库进行比对。表4是基于pLink的肽段交联信息，PRDX3通过第229位半胱氨酸与PRDX1第173位半胱氨酸交联，score值0.0028，b、y例子匹配良好，交联位点可信。

2.7验证PRDX1与PRDX3的结合位点

本研究将PRDX3蛋白第229位的半胱氨酸C定点突变成丙氨酸A后，测序确认突变效果。通

2161.0AbsorbanceinA450nm/ODvalue0.80.60.40.20.0

PRDX（）3+

中山大学学报（医学版）

1.0AbsorbanceinA450nm/ODvalue0.80.60.40.20.0

第40卷

PRDX（）3+PRDX（）3-WT

PRDX（）3-WT

02448

t/h

7296120

A

14402448

t/h

7296120

B

144

A：786O-PRDX（）vs786O-PRDX（），P=0.001，F=11.60，n=3；B：786O-PRDX3KNvs786O-PRDX3NCi，P=0.106，F=2.52，n=33+3-

图3生长曲线测定结果

Fig.3CellproliferationratedetectedbytheCCK-8assayinfivecelllines

表4

Table4

AccessionDescriptionP30048Q06830P32119Q6S8J3P98170P68104P52732O60313-2P19474Q5HYQ13162

基于质谱分析及数据库搜索的蛋白质鉴定信息

Unique2828291121494022401

ProteinidentityinformationforproteininteractionwithPRDX3basedonLC/MS-MS

Score13760.87714.62552.20525.03260.248.87202.02197.03177.79155.681.81Coverage83.2076.8872.7369.2255.72.7650.1944.8345.0525.249.77

PeptidesPeptidesPSMs282521291421494022429

4009285196199106685956

AAs2561991075198497271462997475

MW[ku]27.722.1121.321.956.630.5119.1115.8276.4.150.1

calc.pI7.788.135.976.206.656.299.015.7.876.386.05Thioredoxin-dependentperoxidereductase,mitochondrialPeroxiredoxin-1Peroxiredoxin-2

POTEankyrindomainfamilymemberEE3ubiquitin-proteinligaseXIAPPeroxiredoxin-4

Elongationfactor1-alpha1Kinesin-likeproteinKIF11protein,mitochondrialFilamin-AIsoform2ofDynamin-like120kuE3ubiquitin-proteinligaseTRIM21

631056

492607过lipo2000转染试剂，将突变前后的PRDX3过表达质粒分别采用瞬时转染的方式转入786-O细胞系中，48h后裂解细胞分别进行pull-down试验。Westernblot的结果表明，突变之后，不再能检测到PRDX1条带，而突变之前仍可以看到PRDX1条带（图5），证明两者是通过二硫键相互作用的。两者相互作用，可能共同参与了氧化还原过程，也可能由于与PRDX1相互作用，解除了对PRDX3的抑制，使相关胞内信号得以传递。

3讨论

本研究首次发现PRDX3在肾透明细胞癌组织中显著下调表达，按照下调表达的平均倍数，在肾透明细胞癌786-O细胞系中过表达了PRDX3基因。过表达PRDX3基因的肿瘤细胞生长速度显著变慢，PRDX3的表达水平可能直接影响了肿瘤细胞的生长。通过pull-down实验和westernblot试验

第2期郑丹琴，等.过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

217表4

Table4

Cross-linkProteins基于pLink的肽段交联信息

cross-linkanalysisforPRDX3andPRDX1basedonthepLinksoftware

Cross-linkSitesScore2.80E-03

MolecularMass（ua）4109.97

Tolerance（ppm）-3.41

sp|P30048|PRDX3_HUMAN（229）-LVKAFQYVETHGEVCPANWTPDSPTIK-sp|Q06830|PRDX1_HUMAN（173）

HGEVCPAGWKPRDX3-flag

Non-reducing

Reducing

Marker

ku

PPI

634835PRDX3

26

tion，lineLine41isismarkernon-reducingline

condition，line2-3arereducingcondi⁃

图4在还原/非还原条件下pull-down的胶图

Fig.4Thegelmapofpull-downanalysisbySDS-

PAGEinreduceandnon-reducecondition

PRDX3

PRDX3-C299A（+）

（-）

（+）

（-）

Anti-PRDX3Anti-PRDX1

图5Pull-down试验验证PRDX3与PRDX1的相互作用Fig.5

SitemutationforPRDX3forvalidatingPRDX3-PRDX1interaction

证明PRDX1与PRDX3通过二硫键直接相互作用。PRDX3不但能调节胞内ROS水平［10］c-Myc发生等过程转录因子的下游靶标，［11］。两者的相互作用可能引起了参与细胞凋亡、，而且还肿瘤是ROS的变化，也可能介导了信号传递，进一步影响了肿

瘤细胞的生长。

PRDX3在多数的癌组织中上调表达，但在肾透明细胞癌中PRDX3下调表达，猜想在肾透明细

胞癌中制等PRDX3Xi的表达可能在某种程度上被抑制。［12］报道称低氧诱导因子1α（HIF1α）能够抑PRDX3的表达，从而促进ccRCC细胞增殖。

PRDX3作为线粒体主要参与氧化还原的蛋白，还能参与信号的。PRDX3表达减低，或许使某种信号不能传递。在我们的实验中，我们将PRDX3的表达量在原有基础上又下调了一倍，但并未观察到明显的细胞表型变化。PRDX3的这一水平表达，可能还不足以引起胞内信号的变化。是否PRDX3的表达量与信号传递有关系，我们将尝试对PRDX3进行基因敲除，继续探究。

肾透明细胞癌的发生发展是一个多基因参

与的过程，目前已知在肿瘤的发生发展过程中，PRDX3与Nrf2、Abrin、Srx、FOXO3A等蛋白存在相互作用［13-16］，共同影响肿瘤细胞的生长，参与肿瘤的发生发展过程。本研究中首次发现PRDX3与PRDX1存在相互作用，也发现PRDX3通过二硫键形成了同源二聚体。PRDX3通过与PRDX1的互作以及自身形成的二聚体，是否解除了对PRDX3的抑制，介导信号传递，从而影响肿瘤细胞的生长，还需进一步研究证明。

肿瘤细胞过度增殖的特性之一就是胞内ROS增加，ROSPRDX3的表达可明显调节胞内ROS水平［10］。胞是生长。未来将进一步检测胞内是一把双刃剑，过高或过低均不利于肿瘤细ROS水平的变化，阐述PRDX3表达量与胞内ROS的关系，揭示

PRDX3低表达与肾透明细胞癌细胞生长速率的关系。从蛋白表达水平来看，肾透明细胞癌中PRDX3PBRM1下调表达，可与其他潜在的肿瘤标志物［17］、ErbB3［18］、LHX2［19］等协同预警肾透明细胞癌。提高PRDX3的表达量，肿瘤细胞生长速

率明显减慢，提示可以开发基于PRDX3的肾透明细胞癌靶向药物。

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（编辑

孙慧兰）

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