QuickTiter

品说明书

【产品名称】

通用名：QuickTiter™慢病毒滴度试剂盒

英文名：QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit (Lentivirus- Associated HIV p24)

【包装规格】

96人份/盒。

【货号】

VPK- 107 96次；

VPK- 107- 5 5 x 96次。

【简介】

HIV-1慢病毒载体是基因转移研究中应用前景广泛的载体之一。慢病毒载

体具有感染期和非期细胞的特性

1-2

。慢病毒包膜质粒引入VSV-G（水

泡性口炎病毒包膜G）蛋白后使慢病毒感染寄主的范围扩大，可以向逆转录病毒之前不能感染的细胞类型如神经元、淋巴细胞和巨噬细胞传递基因。同时，体外试验证明慢病毒对大脑、肝脏、肌肉、视网膜等并没有毒性和免疫反应。近年来，慢病毒系统被广泛应用于体内和体外的多种细胞系和原代细胞中的siRNA高效整合。

慢病毒颗粒是由3~4个编码病毒组成部分的质粒通过瞬时感染293T细胞生产的。在感染48~72内可以收获含有病毒颗粒的包装细胞。为了确保假病毒的活力和控制每个靶细胞的中病毒的拷贝数，在进行转导试验之前需要确定病毒滴度。病毒滴度可以通过感染HT-1080细胞或者Hela细胞然后使用抗生素筛选稳定克隆。然而这种方法需要几周的时间培养大量的稳定细胞株，然后进行细胞计数和病毒滴度的计算。

HIV p24 ELISA 技术也被用于慢病毒样品的滴度测定，但这个方法检测的是慢病毒颗粒上p24和在瞬时转染过程中293T细胞的产生的游离的p24的总量。因此总p24的量（慢病毒p24和游离p24）并不能用于精确的慢病毒样品滴度的检测。

Cell Biolabs’ QuickTiter™慢病毒滴度试剂盒（慢病毒HIVp24蛋白）是一种只检测和定量慢病毒HIVp24核心蛋白的酶联免疫试剂盒（参考下面的分析原理）。慢病毒HIVp24蛋白与ViraBind™慢病毒试剂（专利技术）可形成复合物沉淀，而游离的p24仍然在上清液中，从而可用HIV p24 ELISA.试剂检测慢病毒HIVp24蛋白含量。该试剂盒具有高灵敏度，可检测到浓度为1 ng/mL的HIVp24蛋白，或者慢病毒样品中大约104到105TU/mL VSVG-假病毒。每个试剂盒都提供了足够的标准品和慢病毒样品，可完成96次试验。

Cell Biolabs’ QuickTiter™慢病毒滴度试剂盒（慢病毒HIVp24蛋白）提供了一套高效快速定量检测病毒上清液和纯化病毒滴度的试剂。

【技术原理图】

【试剂盒成分】

一、盒1（室温运输）

产品英文名 1.ViraBind™ Lentivirus Reagent A 2.ViraBind™ Lentivirus Reagent B 3.Sample Diluent 4.Anti-p24 Antibody Coated Plate 5.FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody 6.HRP-Conjugated Anti-FITC

Monoclonal Antibody 7. Assay Diluent 8. 10X Wash Buffer 9. Substrate Solution 10. Stop Solution

产品中文名 ViraBind™慢病毒试剂A

ViraBind™慢病毒试剂B 样品稀释液

产品编号 310701

包装 1管 1.0ml

310702 1管 1.0ml 1瓶，50ml，含0.5%的

Triton X-100 96孔板

310703

P24抗体包被板 FITC标记的抗p24的单克隆抗体 HRP标记的抗FITC的单克隆抗体 检测稀释液 10×洗涤液 底物液，显色液 终止液

310801

310810 1管，20µl

310811 1管，20µl

310804 310806 310807 310808

1瓶，50ml 1瓶，100ml 1棕色瓶，12ml 1瓶，12ml

二、盒2（冰袋运输）

1. Recombinant p24 Standard（重组p24标准品，产品编号310809）：100µl，浓度为10µg/ml的热灭活的重组HIV1 p24抗原，溶液为TBS+BSA。

三、未提供的材料

1. 病毒标本：纯化的病毒或未纯化的病毒上清液 2. 细胞培养基 3. 微型离心机

4. 10µl到1000µl可调式单道移液器及头 5. 50µl到300µl可调式多道移液器及头 6. 多通道微量吸液器

7. 酶标仪（450nm或620nm）

四、储存条件

 收到后，将重组p24标准品分装，并放在-20℃保存，避免反复冻融。其余成

分放4℃保存。

【试剂配制】

 1× Wash Buffer：用去离子水稀释10× Wash Buffer到1× Wash Buffer，

并搅拌均匀。

 FITC-Conjugated Anti-HIV1 p24 Monoclonal Antibody and HRP-Conjugated

Anti-FITC Monoclonal Antibody：使用前用Assay Diluent将FITC标记的抗体和HRP标记的抗体1:1000稀释。稀释后的溶液不能存储。

【制作标准曲线】

1. 取8个Eppendorf管，编号1-8（下表）。1号管取990µl Sample Diluent，加入10µl重组p24抗原标准品，混匀，配制成校准品1（100ng/ml）；管2中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品1，混匀，配制成校准品2（50ng/ml）；管3中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品2，混匀，配制成校准品3（25ng/ml）；管4中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品3，混匀，配制

成校准品4（12.5ng/ml）；管5中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品4，混匀，配制成校准品5（6.25ng/ml）；管6中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品5，混匀，配制成校准品6（3.125ng/ml）；管7中取500µl Sample Diluent，加入500µl校准品6，混匀，配制成校准品7（1.5625ng/ml）；管8中取500µl Sample Diluent，配制成校准品8（0ng/ml）。

表1 p24抗原标准品制备

2. 将8管涡旋混匀，并37℃孵育30min。

【慢病毒样品的准备和灭活】

1. 用新鲜培养基稀释慢病毒上清液，保证每份样品终体积为1ml（可选）。单独培养基孔作为阴性对照。

注意：对未知样品，我们推荐每份样品做多个稀释。

2. 加入10μl ViraBind™ lentivirus Reagent A，来回颠倒混匀。立即添加10μl ViraBind™ lentivirus Reagent B，颠倒混匀，37ºC孵育30分钟。

3. 12000rpm离心5min。小心移除上清，加入250μl Sample Diluent溶解颗粒。涡旋混匀，37ºC孵育30分钟让病毒灭活。

【操作方法】

1. 使用前，准备好所有试剂并混合均匀。

2. 每个慢病毒样品，HIV p24标准品，空白和对照培养基都必须做两个复孔。 3. 添加100μl灭活的慢病毒样品或p24抗原标准品到p24抗体包被板。 4. 用封板膜将96孔板密封，置37℃孵育4小时或4℃过夜。

5. 去除封板膜，弃去96孔板孔内液体。加入250μl 1×Wash Buffer（洗涤液）洗

涤，去除洗涤液，重复洗板共三次。倒扣，空干板子，可用纸巾去除多余的洗涤液。

6. 每孔加入100μl稀释后的FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody（FITC标记的抗p24的单克隆抗体）。

7. 用封板膜将96孔板密封，放置到摇床上，室温孵育1小时。 8. 去除封板膜，弃去96孔板孔内液体。洗涤液洗板三次，同5。

9. 每孔加入100μl稀释后的HRP-Conjugated Anti-FITC Monoclonal Antibody（HRP标记的抗FITC的单克隆抗体）。

10. 用封板膜将96孔板密封，放置到摇床上，室温孵育1小时。

11. 去除封板膜，弃去96孔板孔内液体。洗涤液洗板三次，同5。立即进行下一步。

12. 将Substrate Solution（底物液）平衡到室温。每孔加入100μl底物液，包括空白孔。放置到摇床上，室温孵育20~30分钟。

注意：仔细观察板子，如果颜色变化迅速，应立即停止反应。

13. 每孔包括空白孔加100μl Stop Solution（终止液）终止反应。迅速读板（颜色会随着时间消失）。

14. 用酶标仪在450nm波长处，测定各孔吸光度值。

【举例】

下面的结果仅供参考，不能用来作为实际实验结果。

图1 HIV p24 ELISA 标准曲线.

图2 游离的p24不能结合ViraBind™ .

稀释后的重组p24会与ViraBind™ Lentivirus Reagents结合，ELISA可检测上清液和颗粒中的p24的量。

图3 GFP-慢病毒上清液中病毒p24蛋白的滴度测定.

GFP慢病毒重组质粒和包装质粒一起转染293LTV细、 胞（货号LTV-100）。转染48小时后收集培养基。转染3d后检测GFP的感染率（A：GFP慢病毒上清液；B：ViraBind™颗粒）。游离的p24和病毒p24蛋白可通过ViraBind™ Lentivirus 试剂分开，按照说明书操作检测p24的水平。

【慢病毒滴度计算公式】

I 慢病毒外壳蛋白p24滴度计算

根据p24标准品曲线，计算初始慢病毒样品的慢病毒p24蛋白的量。 P24滴度（病毒p24, ng/ml）=p24（ng/ml）×稀释倍数×0.25ml/1.0ml

II 病毒滴度计算

慢病毒颗粒（LP）中大概有2000个p24分子，因此，1LP包括： 2000×24×103/(6×1023) g p24 = 8×10-5pg of p24 或1ng p24 = 1.25 x 107 LPs

对于合理包装的慢病毒载体，1TU大概是100 ~ 1000 LP3-5，因此 106TU/ml=108-9LP/ml=8~80ng/ml

注意：这个计算公式只是慢病毒的物理滴度，而不是慢病毒的感染滴度（TU/ml）。如果检测感染滴度，不同的靶细胞或转导方法，结果会有差异。 。