百合不同远缘杂交基因型对胚培救效果的影响

Vol120　　No14SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences

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文章编号:1001-4829(2007)04-0711-05

百合不同远缘杂交基因型对胚培救效果的影响

屈云慧,熊　丽,吴学尉,王其刚

(云南省农业科学院花卉研究所,云南昆明　650205)

摘　要:选择目标性状清楚的亲本配制远缘杂交组合类型(O×O,O×A,O×L,O×野生种,O×LA),对不亲合组合10～20d的授粉子房进行了离体培养。不同种间及种系间杂交组合类型对百合幼胚的萌发及植株再生有一定的影响:O×O,O×A杂交类型的授粉子房幼胚萌发率最高,O×野生种的幼胚萌发率最低。子房切片培养是较适用的培养方法,但需在发现胚萌发初期使其与子房壁剥离,以避免影响萌发杂种的真实性;胚培养效果还与培养条件有一定的关系,MS+NAA1mg/L+蔗糖6%+琼脂6%,pH

5.5是最适用的培养基,较适的培养室温度20±2℃,光照10h/d,光照强度1000～1500lx(1只日光灯);培养瓶采用不透气膜封

口。胚培养后代以瓶内结球的形式出瓶后,成活率达100%。关键词:基因型;胚培救;百合育种中图分类号:S644.1　　　文献标识码:A

EffectofdifferentgenotypecrossingonembryorescueofLily

QUYun2hui,XIONGLi,WUXue2wei,WANGQi2gang

(FlowersResearchInstituteofYunnanAcademyofAgriculturalSciences,YunnanKunming650205,China)

Abstract:ReciprocalpollinationwasmadebetweenO×O,O×A,O×L,O×wildsandO×LAhybridstypesoflily.Ovarieswereculturedinvitrowithin10-20daysafterpollination.Thebuddingrateofyoungembryoisdifferenteffectonbreedingofdifferentgenotypecrossing.ThebuddingrateishighwiththeovulestissueofO×O,O×Ahybridstypes,andthebuddingrateislowwithO×Whybrids.Theappropri2atemediaforovulesexcisedformovaryoflilyisMS+NAA1mg/L+sugar6%+agar6%,andpH5.5,lightis10h/d,intensityis1000-1500lx.Thesurvivalrateis100%outoftubesoftheoffspringsofovulestissueculture.Keywords:genotype;embryorescue;breedingoflily

　　百合(LiliumL.)花形优美,高贵典雅,是世界上重要的切花材料之一。百合属植物原种有90多种,因其花色丰富,杂交工作十分活跃。20世纪20～30年代一些国家即开始了对百合属种间杂交的研究,并利用远缘杂交获得百合种间杂种。

中国的百合育种工作起步较晚,目前生产上主要使用引进的国外品种。充分利用云南省的百合种质资源优势,选育具有云南特色,适于本省生产条件的优质、高效、抗病百合新品种是云南球根花卉产业发展亟待解决的关键问题。

胚培救技术是百合远缘杂交育种中的关键技

术,子房切片培养、胚珠培养、胚培养等技术在国外广泛应用于克服百合远缘杂交育种中受精后幼胚发育障碍。由于不同杂交类型所需技术关键不同,各种胚培救技术对不同基因型杂交组合的效应也不同。本研究选择包括云南野生百合及国内外各类优异亲本,以东方百合杂种系为母本,配制了5个不同的杂交组合类型,包括4个远缘杂交组合类型,以子房切片培养(ovarysliceculture,OSC)方法为主,对授粉后8～23d的子房和幼胚进行了离体培养挽救,在探讨和评价百合远缘杂交胚培救效果,提高杂交成功率的同时,对获得的杂种植株进行增殖培养,为百合远缘杂交育种提供优化配套的胚培救技术和大量远缘杂交材料,对开展具有云南特色的百合商业新品种的选育提供技术支持。

　　收稿日期:2006-03-08　　基金项目:云南省基金(2003C028Q)资助

作者简介:屈云慧(1972-)女,云南大理人,副研究员,多年从事花卉组织培养技术及组培辅助花卉育种的相关技术研究。

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表1　百合远缘杂交胚培救材料

Table1　Thematerialoflilybreedingintesting

编号

NumberH1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15

母本

FemaleSorbonneSorbonneSorbonneSorbonneStarGazerTomSiberiaStarGazerTomStarGazerStarGazerTomStarGazerSiberiaSiberia

父本

MaleBelpassoBerniniBelpassoGelria

组合类型

Combinationstype

O×O

胚龄(d)

Embryoage

232223

田间结果

Resultoffarm

采收到种子采收到种子采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子未采收到种子

O×L221317

雷2

Gelria

岷江百合岷江百合淡黄花百合

RoyalSongRoyaldiscoverRoyaldiscoverIberfloraSoleMioAdelina

O×W898

O×LA8128

O×A9129

　　注:O为东方百合杂种系,为麝香百合;A为亚洲百合杂种系;W为中国野生百合。Note:‘O’meansOrientalhybrids;‘L’meansLiliumlongi2

florum;‘A’meansAsiatichybrids;‘W’meanswildvarietyofChina.

1　材料与方法

111　供试材料

1.2.2　培养条件　①杂种幼胚培养基:MS+NAA1mg/L+蔗糖3%+琼脂6%,pH5.5;②胚培后代

增殖培养基:MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂6%,pH5.8;③胚培后代生根结球培养基:MS+NAA0.1mg/L+蔗糖6%+琼脂5%,pH5.8。培养条件培养室温度20±2℃,光照10h/d,光照强度1000～1500lx(1只日光灯);培养瓶采

用于试验的材料由云南省农科院花卉研究所百合选育种工作组提供。共5个杂交组合类型,15个杂交组合(表1)。112　培养条件1.2.1　取材与接种　将人工授粉后15d左右的受

用不透气膜封口。

精子房整个切割下来,经40℃低温存放过夜。用75%的酒精棉球对其表面进行擦拭2～3次,再用75%的酒精浸泡消毒1min,然后在0.1%升汞溶液中处浸泡15min,无菌水洗2次,主要选取中间靠上略有膨大的部位,将子房横切为0.2cm的薄片进行培养。

2　结果与分析

211　适合子房切片培养材料的选择

有报道已表明,百合幼胚的胚龄与胚培救效果有一定的关系。我们在试验中也证实了这一结论。百合进行杂交授粉后,不同杂交组合的子房发育有

图1　经培养后褐化的了房切片

Fig.1　Thebrownigovarysliceaftertissueculture

图2　经培养后膨大的胚珠

Fig.2　Theexpansionovaryaftertissueculture

4期　　　　　　屈云慧等:百合不同远缘杂交基因型对胚培救效果的影响713

图3　膨大胚珠中的幼胚萌发

Fig.3　Theyoungovulebourgeonintheexpansionovary

图4　胚培后代的结球培养Fig.4　Theheadingcultureoftheoffspringbyembryoculture

差异,有些不亲合的配组在发育的前期就表现出萎缩的状况。选择合适的时期进行子房的离体培养,对切片培养结果有明显的影响(试验方法与结果另报道)。根据多次试验与观察,本试验根据子房发育状况,主要是膨大及萎缩现象的观察,依照不同的杂交配组,采取了授粉后8～23d,每个组合2～3个子房。

经灭菌处理后,主要切取顶端至中部,有膨大现象的部位,由于子房的生长状况不同,每个子房可切片8～15片。此时子房切片的胎座中,可肉眼看见略为透明的膨大胚珠。由于培养材料前期的生长状况有差异,每个子房切片肉眼可见的胚珠为9～15个。

212　不同杂交组合子房切片的膨大状况及胚珠萌发情况子房切片在培养基中培养7～10d后,子房壁开始增厚,胎座中部的胚珠开始膨大;培养25～30d以后,有的子房切片从胚珠处开始褐化,直到完全失去生命力(图1);而有的切片中幼胚膨大明显,呈浅绿色(图2)。在此期间多数培养材料经3～4次转瓶,少数长势较好的膨大胚珠在转接时,切去周边的部分子房壁,采用胚珠结合胎座培养(ovulewithpla2centaculture,OPC)和胚独立培养方法(youngsingleovuleculture,YOC)进行。100d以后,陆续有胚珠开始萌发,并长成幼苗(图3)。

我们于培养150d后,比较了各个杂交组合幼胚的出苗情况(表2)。

表2　不同杂交组合子房切片的培养及胚珠萌发情况

Table2　Theovarysilicecultureindifferenthybridsandovulebourgeonoflily

杂交组合编号

H1H2H3H4H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15

接种子房切片(片)

24254081518162018192425282420

培养胚珠数(株)

36037560072135270160180162190240250336288240

胚珠最初萌发时间(d)

10398110110107105-135130110108128122120125

胚珠萌发数(株)

821232131217490117494050746843

萌发率(%)

22.832.835.516.712.618.206.14.325.816.720.022.023.617.9

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　　从表2的观察结果表明,由于百合各个杂交组

合亲本来源及遗传背景的不同,杂交配组的类型对培养效果有明显的影响。O×O类型的子房在取材时表现出较好的长势,在培养过程中萌发率最高,H3的萌发率达到35.5%,而且胚珠的长势最好;O×W类型的杂交子房在发育过程中,因在田间发育的后期有萎缩现象,所以培养取材的胚龄较小,在培养过程中萌发率最低,H9仅为4.3%,而且长势不好。尤其是H7(Siberia×岷江百合)的3个培养子房切片均未获得萌发的幼胚植株。其它组合类型O×A、O×LA和O×L都有再生的幼胚植株。从亲缘关系分析,O×O类型属种系内杂交,亲和力较好,在田间也收到了一定数量的正常种子;其它的组合均属于远缘的种系外杂交,但在发育前期均有胚的生长。虽然所选取的O×W类型中的野生岷江百合和淡黄花百合均属于亚洲百合系列,但可能由于其在人工栽培条件下的驯化生长仍存在一定的不适应性,在杂交配组后子房的发育有障碍。从整个培养结果观察,在经多次试验的改进后,本试验所采取的培养方法是有效的,采用的取材方法和培养条件对百合幼胚的生长有利。所培养的材料大部分均有萌芽现象,并获得了一定数量的杂交幼胚再生植株。213　胚龄(授粉的发育时间)及培养条件对幼胚萌发的影响

所培养材料的胚龄阶段内,胚龄对幼胚的萌发无明显的影响。胚龄最小为8d,最大为23d均可培养出杂交后代。但胚龄不同,胚萌发时间有一定的差异。在同一杂交类型中,H12的胚龄8d,胚萌发时间为128d,H11的胚龄12d,胚萌发时间为108d;H14的胚龄12d,胚萌发时间为120d,H15的胚龄9d,胚萌发时间为125d。胚龄越小,胚萌发需要的时间越长。

本试验采取的不同培养方法主要针对培养材料转接时的生长状况,未观察到对培养结果有明显的影响。只是在培养过程中,子房壁、胎座等组织可能会因适宜的培养条件产生愈伤组织而分化出芽,影响培养出的再生植株的杂种真实性,所以在试验后期,我们采用ARP2PCR(anchoredrandomprimer-PCR)法对部分胚培后代进行了杂种鉴定。在培养过程中,对少数胚大明显的胚珠采取了剥离培养,但培养材料均出现玻璃化和褐化现象,在培养后期未观察到胚的萌发。可能试验所采取的培养条件不适应于剥离胚的培养;培养基的pH值对培养效果有一定的影响。当pH值超过5.8时,培养物的褐化现象较明显。

214　胚培后代的结球培养

将萌发的胚培后代接种到培养基②中进行增殖培养,继代3次后,每个胚培后代增殖到20株左右后将其分离成单株,去除叶片后接种到培养基③中培养。20～30d后,瓶内直接生成的小籽球色白或粉红,鳞片紧实,无叶片,根系发达(图4),出瓶后可直接下地种植,定植后成活率达到100%。

3　讨　论

　　云南有野生百合20余个种,占世界百合资源的1/4。据资料报道在百合杂交育种历史中,已经用过

的中国百合种质资源不足一半,中国百合种质资源培育新品种的潜力很大。以现在最流行的东方百合为例,有的香气浓郁闷人,有的清淡或无味。但在云南的野生百合中,大理百合及玫红百合的香味雅淡宜人;在花形方面,云南野生百合中的钟状花(玫红百合、滇百合、尖被百合等)、喇叭状花(王百合、淡黄花百合、野百合、泸定百合等)及卷瓣形花(紫斑百合、大理百合、宝兴百合等),正是国际上丰富百合花形育种发展的趋向,同时,云南野生百合资源在抗性方面具有的优势,正吸引着育种家的注意。但在百合的远缘杂交过程中,杂种胚不能正常发育。本试验认为,在百合远缘杂交育种中,采用子房切片离体培养技术进行胚挽救是一种有效的方法。在合适的胚龄阶段,不同种间及种系间杂交组合类型对百合幼胚的萌发及植株再生有一定的影响,如O×O、O×A杂交类型的授粉子房幼胚萌发率最高,O×野生种的幼胚萌发率最低。

培养基中的糖浓度、激素浓度、pH值的大小以及培养条件不是各自独立地对培养有影响。胚培养后代以瓶内结球的形式出瓶后,成活率大大提高。出瓶的小籽球经过春化处理,可于次年长出地上茎,在一定程度上缩短了杂种后代种球的培育周期,可于2～3年后开花筛选。

由于不同杂交类型所需技术关键不同,各种胚培救技术对不同基因型杂交组合的效应也不同,因此,在实际育种工作必须根据自己所使用的杂交材料特点,进行深入的试验研究,才能达到育种的预期目标。参考文献:

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(责任编辑　王家银)