食物中维生素B12的测定方法

微生物法 1.原理

维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是\"微生物法\"它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。 2.适用范围

GB/T 17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测 3.仪器

电热恒温培养箱

电热手提式压力蒸汽消毒器 液体快速混合器 离心机

722光栅分光光度计 硬质玻璃试管 4.试剂

（1） 0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀释至1000ml。 （2） 0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。 （3） 10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。

（4） 0.1mol/L氢氧化钠：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。

（5） 溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。

（6） 培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。

（7） 100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。

（8） 1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。 （9） 琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。 （10） 1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。 5.菌种的制备与保存

5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌 ATCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。

5.2种子培养液的制备：加0.5ml 50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。 6.操作步骤

整个步骤要避光

（1） 样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存

滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。

（2） 接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。

（3） 试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。

（4） 接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时

（5） 测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。 7.计算

各样管的吡哆醇含量A为：

A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3 则样品的吡哆醇含量为： mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104

每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3； 取液量分别为V1，V2，V3 样品重W（g）取液量V（ml）， 定容至100ml 8.注意事项

（1） 所有步骤需要避光处理

（2） 培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为宜。 （3） 本实验所有用水皆采用蒸馏水。

食品中维生素B6的测定

【GB/T 17407—1998】

本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册（AOAC）公定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系统研究而制定出来的。本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。

本标准由中华人民共和国卫生部提出。

本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。

本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。

本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 1 范围

本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。 本标准适用于各类食品中维生素B6的测定。

2 原理

卡尔斯伯(Saccharomyces Carlsbrgensis)酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。本方法检出限为0.1ng。 3 试剂和培养基

本实验所用的水均为蒸馏水。所用的试剂均需分析纯。

3.1 0.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相对密度为1.84的硫酸加水稀释至1000mL。 3.2 4mol/L、1mol/L及0.1mol/L氢氧化钠溶液。 3.3 25%(V/V)乙醇溶液。

3.4 维生素B6标准储备液(0.1mg/mL)：精确称取0.1220g经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇定容至1000mL。冰箱中保存。

3.5 维生素B6标准中间液(1.0μg/mL)：吸取5.00mL维生素B6标准储备液于500mL容量瓶中，用25%乙醇定容。冰箱中保存。

3.6 维生素B6标准应用液(50ng/mL)：临用时吸取5.00mL维生素B6标准中间液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。 3.7 琼脂

3.8 吡哆醇Y培养基(Pyridoxine Y medium Difc 00951－15－2)：称取5.3g吡哆醇Y培养基，用水稀释至100mL。用时现配。

3.9 琼脂培养基：称取5.3g吡哆醇Y培养基、1.2g琼脂于烧杯中，加入维生素B6标准中间液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加热溶解，趁热尽快分装入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。制成的斜面培养基，于4℃冰箱内保存。

3.10 生理盐水：称取0.9g氯化钠溶解于100mL水中。每次使用前，分别倒入2～4支15mL试管中，每支约10mL，塞上棉塞于121℃高压灭菌5min，备用。 3.11 0.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1 mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。 4 仪器和设备

4.1 实验室常用设备。 4.2 电热恒温培养箱。 4.3 压力蒸气消毒锅。 4.4 液体快速混合器。 4.5 离心机。

4.6 分光光度计。

4.7 耐热硬质玻璃试管：12mm(i.d)³160mm。 5 菌种与培养液的制备及保存 5.1 储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。

5.2 种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制备2～4管备用。 6 操作步骤

6.1 种子液的制备：需无菌操作。用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母菌转种到种子培养液(5.2)中塞上棉塞，以45°倾斜度于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL

稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。 6.2 样品提取液的制备

称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。 6.3 样品试液管的制备

每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.4 标准系列管的制备

每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.5 灭菌

样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。 6.6 接种和培养

待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。 6.7 测定

将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。 7 计算

以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。

c＝(u1十u2十u3)/3………………………………(2) 式中：X——样品中维生素B6的含量，mg/100g； c——样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL； μ——各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL； V——样品提取液的定容总体积，mL； m——样品质量，g；

100/106——折算成每100g样品中维生素B6毫克数。 8 结果的重复性

同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%。

GB/T 5009.1-2003

5 菌种与培养液的制备及保存 5.1 储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(Saccharomyces Carlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。

5.2 种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制备2～4管备用。 6 操作步骤

5.2.2 接种液的制备：需无菌操作。 使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两个管，以（45°倾斜度）于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。

6.2 样品提取液的制备

称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL 0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。 6.3 样品试液管的制备

每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.4 标准系列管的制备

每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。 6.5 灭菌

样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。 6.6 接种和培养

待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。 6.7 测定

将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。 7 计算

以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。

c＝(u1十u2十u3)/3………………………………(2) 式中：X——样品中维生素B6的含量，mg/100g； c——样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL； μ——各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL； V——样品提取液的定容总体积，mL； m——样品质量，g；

100/106——折算成每100g样品中维生素B6毫克数。 8 结果的重复性

同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%。

微生食物中维生素B12的测定方法

微生物测定法 1.原理

维生素B12对于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生长是必需的，在一定生长条件下，Lactobacillusleichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。本方法最低检出限0.001ng。 2.适用范围

本方法参考\"Official Methods of Analysis of theAssociationof official AnalyticalChemists\"、\"MethodsofVitamin Analysis\"以及\"Methodsofthe Microbiological Analysis ofSelectedNutrients\"。本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。 3.试剂

本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。 3.1 甲苯

3.2 柠檬酸（C6H8O7²3H2O） 3.3 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 3.4 焦亚硫酸钠（Na2S2O5） 3.5 抗坏血酸（生化试剂） 3.6 无水葡萄糖 3.7 无水乙酸钠

3.8 L-胱氨酸（生化试剂） 3.9 D,L-色氨酸（生化试剂）

3.10 10mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。 3.11 （1+4） 乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。

3.12 酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200 ml3mol/L盐酸，121℃高压水解6小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。（该试剂也可从Difco公司购得，产品号为No.0288-15-6。）

? 酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素，确保基本培养基中不含待测定的维生素B12，但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉（Sigma公司），这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含维生素B12。

3.13 腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，以水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。

3.14 维生素溶液Ⅰ：称取25mg核黄素，25mg盐酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。

3.15 维生素溶液Ⅱ：将50mg对氨基苯甲酸，25mg泛酸钙，100mg盐酸吡哆醇，100mg盐酸吡哆醛，20mg盐酸吡哆胺，5mg叶酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。

3.16 甲盐溶液：称取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。

3.17 乙盐溶液： 称取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O溶于水并定容至500ml，加5滴浓盐酸。

3.18 黄嘌呤溶液：称取1.0g黄嘌呤溶于200ml水中，70℃加热条件下，加入30mlNH4OH（2+3）L-天冬酰胺溶于水中，并定容至100ml。

3.19 吐温80溶液：将25g吐温-80溶于乙醇并定容至250ml。 3.20 维生素B12标准溶液（均使用棕色试剂瓶） （1）3.20.1维生素B12标准储备溶液（100ng/ ml）：称取50μg（精度0.01mg天平）维生素B12暗红色针状结晶，用（1+4）的乙醇溶液定容至500ml，储存在2～4℃条件下。 （2）3.20.2维生素B12标准中间液（1ng/ml）：取1ml储备液用（1+4）的乙醇定容 至100ml.贮存于2～4℃条件下。

（3）3.20.3 维生素B12标准使用液（0.02ng/ ml）：取1ml中间液用水定容至50ml，用时现配。

? 维生素B12见光易分解，因此在配制标准液时要尽量避光，并且一定要使用棕色试剂瓶。 3.21 基本培养基：将下列试剂混合于500ml烧杯中，加水至200ml，以溴甲酚紫作外指 示剂，用10mol/L氢氧化钠液调节pH为6.0～6.1，用水稀释至250ml。 酸解酪蛋白25ml

腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液5ml 天冬胺酰溶液5ml 吐温-80溶液5ml 甲盐溶液5ml 乙盐溶液5ml 维生素溶液Ⅰ5ml 维生素溶液Ⅱ5ml 黄嘌呤溶液5ml 抗坏血酸1.0g L-胱氨酸0.1g D,L-色氨酸0.1g 无水葡萄糖10.0g 无水乙酸钠8.3g

该培养基也可从Difco公司购得，产品号为No.0457-15-1。 ? 由于国内某些试剂纯度不够，所以自行配制的培养基较浑浊，严重影响到最后的浊度测定结果，因此建议最好使用进口培养基。

3.22 琼脂培养基：在600ml水中，加入15g蛋白胨，5g水溶性酵母提取物干粉，10g无水葡萄糖，2g无水磷酸二氢钾，100ml番茄汁，10ml吐温-80溶液，每500ml液体培养基加5.0~7.5g琼脂，加热溶解，用10mol/L氢氧化钠调节pH为6.5~6.8，然后定容至1000ml，分装于试管中，于121℃高压灭菌10分钟，取出后竖直试管，待冷却至室温后于冰箱保存。 3.23 生理盐水：称取9.0g氯化钠溶于1000ml水中，。每次使用时分别倒入2～4支试管中，每支约加10ml，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，备用。

3.24 0.4g/L溴甲酚紫指示剂：称取0.1g溴甲酚紫于小研钵内，加1.6ml 0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。 4.仪器与设备

4.1 实验室常用设备 4.2 电热恒温培养箱

4.3 压力蒸汽消毒器 4.4 液体快速混合器 4.5 离心机

4.6 硬质玻璃试管：20mm³150mm 5.菌种与培养液的制备与保存

5.1 储备菌种的制备：Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）接种于直面琼脂培养管中，在37±0.5℃恒温箱中培养16~24小时，取出后放入冰箱中保存。每周至少传种二次以上。在实验前一天必须传种一次。?Lactobacillusleichmannii （ATCC7830）的生命力不强，每周一定要至少传代2-3次，否则极易死亡!

5.2 种子培养液的制备：加2ml 0.02ng/ml维生素B12标准工作液和3ml基本培养基于10ml离心管中，塞好棉塞，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却后于冰箱中保存。每次制备两管，备用。

? 加入离心管中的维生素B12标准工作液要适量，过少会阻碍Lactobacillus Leichmanni的生长，过多会使零管中的光密度值增大，影响测定结果的准确性。一般2-3ml即可。 6. 操作步骤

6.1 接种液的配制：使用前一天，将已在琼脂管中生长16~24小时的L.leichmannii 接种于种子培养液中，在37±0.5℃培养16~24小时，取出后离心10分钟（3000rpm），弃去上清液，用已灭菌的生理盐水淋洗2次，再加入3ml灭菌生理盐水，混匀后，将此液倒入已灭菌的注射器中，立即使用。 6.2 水解液的制备：称取1.3g无水磷酸二氢钠、1.2g柠檬酸及0.1g焦亚硫酸钠（Na2S2O5），溶于水中并定容至100ml，用时现配。

6.3 称取适量样品，至于100ml三角瓶中，加70ml水解液，混匀，于121℃高压灭菌10分钟，取出冷却至室温，过滤，然后以溴甲酚紫为外指示剂，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH为6.0~6.1，将水解液移至100ml容量瓶中，定容至刻度。为保证最后样品测定管中的Na2S2O5的浓度≤0.03mg/ml，因此要做适当的稀释。

? 测定管中Na2S2O5的浓度一定要小于0.03mg/ml，过多会抑制L.Leichmannii的生长，因此在称取样品时要考虑到后来的稀释倍数，避免由于稀释倍数过大造成测定管中的维生素B12含量过低，无法检出。

? 实验所用的所有试管必须在烤箱中180-200℃条件下干热灭菌2-3小时。

6.4 样品试管的制备：每组平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0ml样品水解液，并用水稀释至5ml，然后再加入5ml基本液体培养基。

6.5 标准系列管的制备：每组试管中分别加入维生素B12标准工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，使每组试管中维生素B12的含量为0.00ng、0.02ng、0.04ng、0.06ng、0.08ng、0.1ng，加水至5ml，再加入5ml基本液体培养基，需做三组标准曲线。 6.6 灭菌：样品管与标准管均用棉塞塞好，于121℃高压灭菌10分钟。

? 灭菌时间不宜过长，否则会破坏基本培养基中的营养成分，影响Lactobacillus Leichmannii的生长，最好在5-10分钟内。 6.7 接种与培养：待试管冷至室温后，每管接一滴种子菌液，于37±0.5℃恒温箱中培养16~20小时。

? （1）接种前，接种室要在紫外灯下消毒至少30分钟。（2）在接种时，其中一支标准系列0管可不接种，这样可观察此次实验是否存在污染，并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差。

6.8 测定光密度值：于0nm波长条件下，以标准系列中零管调节仪器零点，测定样品管液体及标准管液体的光密度值。

? 首先以未接种的标准系列0管进行仪器调零，然后在用接种后的标准系列0管进行二次调零，之后再测定其他管中液体的光密度值。 7.结果计算

以维生素B12标准系列的不同纳克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。由样品测定管中的光密度值在曲线上查出相对应的样品测定管中的维生素B12含量，再按以下公式计算样品中维生素B12含量： c·V·f

X= --------------×100 m×1000 式中：

X──样品中维生素B12含量，μg/100g： c──测定管中的维生素B12含量，ng： V──样品水解液的定容体积，ml： f──样品液的稀释倍数 m──样品质量，g。

100/1000 ── 单位换算系数 8.注意事项

（1） 全部实验操作应注意避免日光直接照射。

（2） 在人体肠道中，大肠杆菌可以合成维生素B12，因此，此实验极易被污染，在整个实验中，最重要的是注意清洁问题，确保所用的玻璃器皿、操作环境要清洁。