WesternJournalofTraditionalChineseMedicine,2012Vol.25No.11
甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌的分离及鉴定＊
邓毅1，王艳1，丁仁伟1，杨志军1，张艳萍2△
1甘肃中医学院，甘肃兰州730000；2甘肃中医学院附属医院
［摘要］目的：通过对甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌的分离，对甘草同属不同品种内生菌的优势菌种进行初步鉴定，比较二者的生理活性差异。方法：采用NA、PDA培养基对甘草野生与栽培品内生菌进行分离和纯化，并以分离频率比较判断各自优势菌种。结果：野生甘草分离到内生细菌65株，内生真菌7株，优势
菌种为青霉菌属和曲霉属；栽培甘草分离到内生细菌54株，内生真菌6株，优势菌种为青霉菌属；野生与栽培甘草的内生真菌分属于6个属，相同的有5个属，不同的2个属为丝核菌属和木霉属。结论：野生与栽培甘草具有相趋同数量和种类的内生细菌与内生真菌，但二者内生真菌的菌属及优势菌种存在明显差异。［关键词］甘肃；乌拉尔甘草；野生栽培；内生细菌；内生真菌；分离纯化；种类鉴定［中图分类号］R282.7［文献标识码］A［文章编号］1004-6852(2012)11-0008-04
IdentificationandSeparationofEndophytes
inWildandCultivatedGlycyrrhizaUralensisfromGansuProvince
DENGYi１,WANGYan１,DINGRen-wei１,YANGZhi-jun１,ZHANGYan-ping２△
1GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2UniversityHospitalofGansuTraditionalChineseMedicine
ＡｂｓｔｒａｃｔObjective:Tocomparethedifferencesofbiologicalactivitybetweenwildandcultivatedglycyrrhizauralensisthroughtheisolationofendophytesandidentificationondominantbacteriafromendophytesofdifferentspeciesinthesamegenera.Method:EndophytesfromwildandcultivatedGanCaowereisolatedandpurifiedwithNAandPDAbase.Thedominantbacteriawerecomparedandjudgedwithfrequencyseparation.Result:All65strainsofendophyticbacteriaandsevenstrainsofendophyticfungiwereisolatedfromwildGanCao,thedominantbacteriawerepenicilliumsppandmonillales;54strainsofendophyticbacteriaandsixstrainsofendophyticfungiwereisolatedfromcultivatedGanCao,thedominantbacteriawerepenicilliumspp;endophyticfungiisolatedfromwildandcultivatedGanCaowereinthesixgenera,therewerefivesamegenera,twodifferentgenerawererhizocto-niaandtrichoderma.Conclusion:WildandcultivatedGanCaohavealmostthesameamountandkindsofendophyticbacteriaandfungi,butthereexistsremarkabledifferenceingeneraanddominantbacteriaofendophticfungiinboth.
ＫｅｙｗｏｒｄｓGansu;GlycyrrhizaUralensis;wildcultivation;endophyticbacteria;endophyticfungi;isolation
andpurification;speciesidentification
植物内生菌（ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）是指生活在健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，是与宿主植物
［１］
在长期共同进化过程中衍生的一类微生物。内生菌与宿主植物有着密切的共生关系，内生菌在演化过程中发生了基因重组并获得宿主植物的基因，能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分，并具有多种生理活性。本实验对甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品内生菌进行分离与鉴定，从内生菌菌属和优势菌种的角度探讨其宿主植物活性成分的差异。1材料与仪器1.1材料
1.1.1药物野生乌拉尔甘草GlycyrrhizauralensisＦｉｓｃｈ．栽培乌拉尔甘草于２０１１年５月采于甘肃省酒泉市金塔县（经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定为正品）。将新鲜的野生与栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鲜膜分开包装，４℃保存。1.1.2培养基ＰＤＡ固体培养基：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，水１０００ｍＬ，ｐＨ值自然，１２１℃灭菌３０分钟；ＮＡ固体培养基：牛肉浸膏３ｇ，
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蛋白胨８ｇ，琼脂粉２０ｇ，水１０００ｍＬ，ｐＨ自然，１２１℃灭菌３０分钟。
1.1.3主要试剂３％ＮａＣｌＯ（天津市净化材料精细化工厂，批号：２０１００１０９）；０．１％升汞（安徽安特生物化学有限公司，批号：２００８１１１２）；７５％乙醇（安徽安特生物化学有限公司，批号：２００７０７０７）；牛肉浸膏（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：０９０５０４）；蛋白胨（天津市福辰化学试剂厂，批号：２０１００９１１）；琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司，批号：１０１１０３）；葡萄糖（天津市福辰化学试剂厂，批号：２０１０１００２）。
1.2主要仪器ＬＤＺＸ－３０ＦＢ立体压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂生产）；ＳＷ－１Ｆ－ＣＪ无菌操作台（上海新苗医疗器械制造有限公司生产）；ＳＰＸ－２５０－ＧＢ光照培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司生产）；ＢＳ２２４Ｓ电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司生产）；ＸＳ－２１３Ａ显微镜（南京江南光电股份有限公司生产）；ＤＣＤ－２１６ＹＨ冰箱（青岛海尔股份有限公司生产）。2方法
2.1甘草表面消毒条件的筛选将野生及栽培
清洗处理后，分别平均放置于甘草根截成５～６ｃｍ，
４个烧杯中，按表１中所示处理方法，分别取最后１次无菌水冲洗液０．２ｍＬ涂布于ＮＡ固体培养基上，２８℃条件下培养３天，各平行做３次，无菌水作为空白对照组，根据公式计算组织表面杀菌率，观察各处理方式的杀菌效果。见表１。
组织表面杀菌率＝［（未消毒的组织表面细菌数-消毒后的组织表面细菌数）／未消毒的组织表面细菌数］×１００％
表1甘草组织表面消毒条件的筛选
处理1
第1步第2步
第3步第4步
无菌水冲洗75%乙醇浸泡3分钟无菌水冲洗无
处理2
3%NaClO浸泡3分钟0.1%升汞浸泡3分钟75%乙醇3分钟无
处理3
3%NaClO浸泡3分钟0.1%升汞浸泡3分钟无无
处理4
75%乙醇浸泡3分钟0.1%升汞浸泡3分钟无无
注：以上各步间均用无菌水清洗5次。
2.2甘草内生真菌的分离与纯化采用组织块分离法，在无菌操作台上，将甘草根消毒后，用消
按照十字毒解剖刀切成约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，
交叉原则，在每个ＰＤＡ固体培养基各放置５块，然后置于光照培养箱２５℃下培养７天。待组织断面边缘有菌丝生长后，采用挑取法挑取菌落边缘菌丝转入新的ＰＤＡ培养基中，待其长成菌落后，再挑取边缘菌丝，如此反复直到获得纯化菌株后，分别保存于ＰＤＡ试管斜面培养基中，４℃备用。野生甘草内生真菌编号分别为ＪＴＹＦ－００１、ＪＴＹＦ－００２、ＪＴＹＦ－００３……栽培甘草内生真菌编号分别为ＪＴＺＦ－００１、ＪＴＺＦ－００２、ＪＴＺＦ－００３……。
2.3甘草内生细菌的分离与纯化采用菌液涂抹分离法，无菌操作台上，将“２．２”项剩余甘草组织切碎，于灭菌研钵中加３ｍＬ无菌水反复研磨，用微量移液枪吸取１ｍＬ研磨液，移至试管中，加９ｍＬ无菌水，混匀，后用微量移液枪再从该试管中吸取１ｍＬ，移至另一试管中，加９ｍＬ无菌水，如此反复将菌液依次稀释成１×１０－１、１×１０－２、１×１０－３、１×１０－４、１×１０－５５个稀释度，做好标记，然后用三角玻璃棒将其涂抹于ＮＡ培养基中，每个稀释度重复３次。在光照培养箱２８℃下培养４天，待培养基上长出菌种后，挑取菌落，经划线法反复纯化菌株，后分别保存于ＮＡ试管斜面培养基中，４℃备用。野生甘
ＪＴＹＢ－００２、草内生细菌编号分别为ＪＴＹＢ－００１、
ＪＴＹＢ－００３……栽培甘草内生细菌编号分别为ＪＴＺＢ－００１、ＪＴＺＢ－００２、ＪＴＺＢ－００３……。
2.4甘草内生细菌的革兰氏染色反应采用革兰氏染色法，将分离到的内生细菌于ＮＡ斜面培养基活化培养４８小时后，按照以下步骤进行染色反
用接种针挑去少许菌落，涂布在干净玻应。制片，
片上１滴无菌水中，风干固定；初染，滴加结晶紫染色１分钟，水洗；媒染，用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约１分钟，水洗；脱色，用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加９５％乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗；复染，用番红染液复染约２分钟，水洗，干燥，镜检，菌体被染成紫色是革兰氏阳性菌（Ｇ＋），被染成红色的为革兰氏阴性菌（Ｇ－）。
2.5甘草内生真菌的鉴定将分离到的内生真菌纯化后，挑取真菌菌株的尖端菌丝接种于ＰＤＡ培养基中进行活化培养，培养数日后根据各真菌菌落的表面形态、大小、颜色、质地、生长速度及边缘形态等宏观特征，并结合光学显微镜观察其孢
产孢结构、菌丝颜色及有无横隔等微观特征，子形态、
［２］
参照魏景超《真菌鉴定手册》，将内生真菌归属。
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2.6优势菌种判断法采用分离频率（ｉｓｏｌａ－ｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ＩＦ）比较判断优势菌种。
分离频率ＩＦ＝某一菌种的分离数×１００％
分离所用培养基数
3结果
3.1甘草表面消毒条件的筛选根据组织表面杀菌率公式得出，处理１杀菌率约为６６％，处理３、４杀菌率接近９４％，处理２的杀菌率达到１００％。因此本实验选用处理２的消毒方式（见表１）。3.2野生和栽培甘草内生菌的分离及染色情况3.2.1甘草内生菌的分离野生与栽培甘草的内生菌经多次分离纯化，共得到内生菌１３２株，其中内生细菌１１９株，内生真菌１３株。内生菌种主要以内生细菌为主，约占菌株分离总数的９０．２％，
内生真菌约占菌株分离总数的９．８％，见表２。
表2野生与栽培甘草内生菌种分离情况
内生细菌
YG
ZGTotal
6554119
内生真菌
7613
注：采用PDA和NA培养基，YG为野生甘草，ZG为栽培甘草，YG共90皿，ZG共90皿。
3.2.2甘草内生菌的染色及分离频率野生甘
占５２．３％，草分离得到内生细菌６５株，Ｇ＋３４株，
Ｇ－３１株，占４７．７％。栽培甘草分离到内生细菌５４株，Ｇ＋２５株，占４６．３％，Ｇ－２９株，占５３．７％。其中染色的显微图片计数球状菌有３２株，杆状菌８７株，见表３，图１—２。
表3野生及栽培甘草内生细菌革兰氏染色及分离频率
菌号分离数/YGG＋与G－分离频率/%分离数/ZGG＋与G－分离频率/%菌号B-1B-2B-3B-4B-5B-6B-7B-8B-9B-10B-11B-12B-13B-14B-15B-16B-17B-18B-19B-20B-21B-22B-23B-24B-25B-26B-27B-28B-29B-30B-31B-3288331510984169222272126181731266511631433626++--+-+++-+++---++-++-++-+++--+-195.673.333.322.020.017.88.92.213.320.048.94.460.04.42.257.840.037.86.726.713.313.311.12.22.2140.02.28.96.780.04.413.36143124252043149521341021193141096639105292+---++--+-+---++-+++-++----+-+-+135.695.62.253.355.644.48.96.731.120.011.14.42.26.78.922.24.424.420.06.72.28.922.220.013.313.36.720.022.211.164.44.4B-33B-34B-35B-36B-37B-38B-39B-40B-41B-42B-43B-44B-45B-46B-47B-48B-49B-50B-51B-52B-53B-54B-55B-56B-57B-58B-59B-60B-61B-62B-63B-64B-65分离数/YGG＋与G－分离频率/%分离数/ZGG＋与G－分离频率/%312317827123516129162641935342041213265214682213513---+-++--++++--+---+-++-----++-++6.72.251.137.817.860.026.76.711.135.626.720.035.657.88.942.277.86.78.944.491.146.771.113.311.146.78.9151.148.928.911.12.26.72722418372331144521715337531283612++----+-+--+---++-++-+60.048.98.940.082.24.473.324.48.9100.04.437.82.211.16.76.7166.768.94.417.880.026.7注：YG为野生甘草，ZG为栽培甘草。“＋”为革兰氏阳性菌，“－”为革兰氏阴性菌。采用NA培养基，YG共45皿，ZG共45皿。
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分离频率/%方分离数/个药·道地药材
菌株号
图１显示野生甘草的内生菌号ＪＴＹＢ－００１、ＪＴＹＢ－０２６、ＪＴＹＢ－０６０的分离数及分离频率明显高于其他菌株，为优势菌种。图２显示栽培甘草的内生菌号ＪＴＺＢ－００１、ＪＴＺＢ－０４９的分离数及分离频率明显高于其他菌株，为优势菌株。
3.3甘草内生真菌鉴定结果野生甘草的７株
真菌编号野生甘草分离数/个F-001曲霉属Aspergillus17F-002青霉菌属PeniTillium2F-003镰刀菌属Fusarium2F-004根霉属Rhizopus23
丝核菌属RhizoTtonia1F-005
F-006青霉菌属PeniTillium8F-007毛霉属MuTor9注：采用PDA培养基，YG45皿，ZG45皿。真菌编号JTYF-001JTZF-001JTYF-006
属
青霉菌属PeniTillium青霉菌属PeniTillium曲霉属Aspergillus
分离频率/%
37.84.44.417.82.251.120.0
内生真菌与栽培甘草的６株内生真菌分属于６个属，相同的属为青霉菌属、镰刀菌属、根霉属、曲霉属、毛霉属，不同的属为丝核菌属、木霉属；野生甘草优势菌株为Ｆ－００１和Ｆ－００６，分属于青霉菌属和曲霉属，栽培甘草优势菌株为Ｆ－００１，属于青霉菌属，见表４—５。
栽培甘草青霉菌属PeniTillium根霉属Rhizopus镰刀菌属Fusarium曲霉属Aspergillus毛霉属MuTor
木霉属TriThoderma
分离数/个
2010310141
分离频率/%44.422.26.731.122.22.2
表4野生及栽培甘草内生真菌的分离数及分离频率
表5野生及栽培甘草优势内生真菌鉴定情况
形态特征
菌丝先是白色，后来变为黄色，基质的颜色则随菌丝颜色的变化而发生变化。同上。菌落黄色，基质为黄色。
显微特征
分生孢子梗单个地发生，在顶部附近有分枝，如青霉状，末端生小梗。同上。
分生孢子梗直立，单胞，球形，小梗自整个表面放射。
4
讨论
植物内生菌的分离与培养受多种因素的影响，本实验在设计时考虑到土壤或空气中细菌的混入、培养基成分、组织液浓度、培养温度、染色反应等因素的影响，且植物的生长环境、土壤条件、生长年限等因素在一定程度上对实验结果也会产
［３］
生影响。饶小莉等从乌拉尔甘草的根茎叶中分离到９８株内生细菌，采用平板对峙法筛选的６株菌株对植物病原菌有明显体外拮抗活性。本实验初步从甘肃野生乌拉尔甘草根中分离出６５株内生细菌，７株内生真菌，内生细菌和内生真菌的优势菌种分别是ＪＴＹＢ－００１、ＪＴＹＢ－０２６、ＪＴＹＢ－０６０和ＪＴＹＦ－００１、ＪＴＹＦ－００６，内生真菌分属于６个属，内生真菌优势菌属是青霉菌属和曲霉属；栽培乌拉尔甘草根中分离出５４株内生细菌，６株内生真菌，内生细菌和内生真菌的优势菌种分别是ＪＴＺＢ－００１、ＪＴＺＢ－０４９和ＪＴＺＦ－００１，内生真菌分属于６个属，内生真菌优势菌属是青霉菌属；野生与
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栽培甘草内生真菌的菌属及优势菌种存在明显差
异；二者菌种菌属的分离数与分离频率也存在差异。因此从内生菌的角度初步说明宿主植物间活性成分存在差异，其生理活性或药理作用也存在程度上的差异。
参考文献
［1］丁仁伟，邓毅.药用植物内生菌活性成分及药效学研究进展［J］.西部中医药，2012，25(3)：109-112.
［2］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979：
405-645.
［3］饶小莉，沈德龙，李俊，等.甘草内生细菌的分离及拮抗菌株
鉴定［J］.微生物学通报，2007，34(4)：700-704.收稿日期：2012-04-27
*基金项目：甘肃省中医药管理局项目(编号GZK-2010-9)作者简介：邓毅(1964—)，男，硕士研究生导师，教授，中药学科学术带头人。研究方向：中药学教学、中药性能与配伍应用及中药不良反应的研究。
△通讯作者：张艳萍(1964—)，女，副主任技师。研究方向：心血管疾病的中医药防治。
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