(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110551683 A(43)申请公布日 2019.12.10
(21)申请号 201910796391.5(22)申请日 2019.08.27
(71)申请人 西安艾尔菲生物科技有限公司
地址 710000 陕西省西安市西咸新区秦汉
新城兰池大道中段规划展览中心A018室(72)发明人 王静 王海江 胡春梅 肖萍 (74)专利代理机构 西安弘理专利事务所 61214
代理人 王蕊转(51)Int.Cl.
C12N 5/077(2010.01)A61K 8/99(2017.01)A61Q 19/00(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
权利要求书2页 说明书13页 附图3页
CN 110551683 A(54)发明名称
人成纤维细胞无血清培养基和制备方法及人成纤维细胞无血清调节培养液的获取方法(57)摘要
一种人成纤维细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/mL，葡多酚为50-200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/mL，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，黄芪多糖为1-50μg/mL，透明质酸0.1-5μg/mL，碳酸氢钠为1.0-3.7g/L。利用无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人成纤维细胞，避免了动物源性成分污染以及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素。
CN 110551683 A
权 利 要 求 书
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1.一种人成纤维细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5～100ng/mL，葡多酚为0～200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/mL，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，黄芪多糖为1～50μg/mL，透明质酸为0.1～5μg/mL，碳酸氢钠为1.0～3.7g/L。
2.如权利要求1所述的一种人成纤维细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基的体积百分比为90～98％，所述无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％。
3.如权利要求1或2所述的一种人成纤维细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基采用DMEM培养基，所述基础培养基或采用DMEM培养基与F12培养基的混合培养基。
4.一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，采用如权利要求3所述的一种人成纤维细胞无血清培养基，具体包括以下步骤：
步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
人成纤维细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人成纤维细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液，在无菌条件下，冻存；
步骤2：制备生长因子浓配液将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β1、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1五款生长因子配制成浓配液A，在无菌条件下，冻存；
步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基；将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、黄芪多糖、透明质酸钠溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液B；
将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的冻存的浓配液A加入混合液B中混合均匀，得人成纤维细胞无血清培养基。
5.如权利要求4所述的一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，所述基础培养基的体积百分比为90～98％，所述无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％；所述维生素组合物浓度为5-100ng/mL，所述葡多酚浓度为50-200μg/mL，所述重组人表皮细胞生长因子浓度为1～50ng/mL，所述重组人碱性成纤维细胞生长因子浓度为50～200ng/mL，所述重组人转化生长因子β1浓度为1～50ng/mL，所述重组血小板衍生生长因子-C浓度为1～10ng/mL，所述重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/mL，所述β-巯基乙醇浓度为50～200μM，所述人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，所述谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，所述黄芪多糖浓度为1-50μg/mL，所述透明质酸浓度为0.1-5μg/mL，所述碳酸氢钠浓度为1.0-3.7g/L。
6.如权利要求4所述的一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，所述步骤1中超滤浓缩至过滤后人成纤维细胞上清液体积的1/15～1/20。
7.如权利要求4所述的一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，所述步骤1中超滤浓缩后加水至总蛋白浓度为10mg/mL。
8.如权利要求4所述的一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，所述步骤2中浓配
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液A的浓度为50ug/mL。
9.一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，其特征在于，采用如权利要求3所述的一种人成纤维细胞无血清培养基制备，具体包括以下步骤：
步骤A：人成纤维细胞的提取：清理包皮组织、剪碎、洗涤，胶原酶消化后离心，弃上清，沉淀加培养基吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10％基础培养基的完全培养液进行培养；待细胞达80％融合时进行传代培养，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；
步骤B：人成纤维细胞的扩增培养：取步骤A中的种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％-90％时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，传代培养基采用人成纤维细胞无血清培养基；
步骤C：收集人成纤维细胞无血清调节培养液：
收集P6到P15代培养过程中的人成纤维细胞调节培养上清液，即得人成纤维细胞无血清调节培养液。
10.如权利要求9所述的一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，其特征在于，所述步骤B传代培养条件为：温度为37℃，CO2浓度为5％。
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说 明 书
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人成纤维细胞无血清培养基和制备方法及人成纤维细胞无血
清调节培养液的获取方法
技术领域
[0001]本发明属于皮肤修复技术领域，涉及一种人成纤维细胞无血清培养基，一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，以及一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法。背景技术
[0002]人成纤维细胞是构成皮肤真皮层的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。可通过自分泌或旁分泌的方式分泌细胞生长因子、胶原蛋白、应激蛋白及其他胞外蛋白，这些细胞分泌的营养物质可协同作用于皮肤，刺激皮肤组织中透明质酸、胶原蛋白、弹性蛋白的再生，修复受损细胞，促进创面愈合。[0003]近年来，人成纤维细胞的体外扩增是在补充有胎牛血清或补充有人的自体血清或基本等同相似的血清的培养基中进行。然而，牛血清、人血清或其它动物血清可能含有血液传播的病原体，牛血清还会激发抗异性生物质蛋白抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答；另外，牛血清会显示出批次间差异，导致性能不一致。
[0004]目前虽然市场上存在一些可购买的人成纤维细胞培养的血清替代物，但是效果仍不甚理想，容易受到某些机械因素和化学因素的影响，致使影响人成纤维细胞的贴壁、增殖以及稳定性的维持。
[0005]人成纤维细胞不仅可以应用到临床治疗中，而且其细胞培养过程中产生的培养上清液也具有非常好的美容护肤作用。
[0006]人成纤维细胞调节培养液(即人成纤维细胞培养上清液)来源于人成纤维细胞体外培养过程中的培养上清，富含多种细胞生长因子，胶原蛋白等生物活性成分，近年来在生物技术领域迅速发展。
发明内容
[0007]本发明的目的是提供一种人成纤维细胞无血清培养基，解决了现有技术中含血清培养人成纤维细胞不安全因素。
[0008]本发明的第二个目的在于提供一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法。[0009]本发明的第三个目的在于提供一种人成纤维细胞无血清培养液的培养方法，其制得的培养液具有抗衰功效。
[0010]本发明所采用的第一个技术方案是：[0011]一种人成纤维细胞无血清培养基，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5-100ng/mL，葡多酚为50-200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/mL，β-巯基乙醇为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，黄芪多糖浓度为1-50μg/mL，透明质酸浓度为0.1-5μg/mL，碳
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酸氢钠为1.0-3.7g/L。
[0012]本发明的第一个特点还在于，
[0013]基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％。
[0014]基础培养基采用DMEM培养基，或采用DMEM培养基与F12培养基的混合培养基。[0015]本发明所采用的第二个技术方案是：
[0016]一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，具体包括以下步骤：[0017]步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
[0018]人成纤维细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90％时，收集人成纤维细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液，在无菌条件下，冻存；[0019]步骤2：制备生长因子浓配液[0020]将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β1、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1五款生长因子配制成浓配液A，在无菌条件下，冻存；[0021]步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基[0022]将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、黄芪多糖、透明质酸钠溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液B；[0023]将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2冻存的浓配液A加入混合液B中混合均匀，得人成纤维细胞无血清培养基。[0024]本发明的第二个特点还在于，
[0025]基础培养基的体积百分比为90～98％，无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2～10％；维生素组合物浓度为5～100ng/mL，葡多酚浓度为50～200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子浓度为1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子浓度为50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1浓度为1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C浓度为1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1～10ng/mL，β-巯基乙醇浓度为50～200μM，人血白蛋白浓度为1～100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，黄芪多糖浓度为1-50μg/mL，透明质酸浓度为0.1-5μg/mL，碳酸氢钠浓度为1.0-3.7g/L。
[0026]步骤1中超滤浓缩至过滤后人成纤维细胞上清液体积的1/15～1/20。[0027]步骤1中超滤浓缩后加水至总蛋白浓度为10mg/mL。[0028]步骤2中浓配液A的浓度为50ug/mL。[0029]本发明所采用的第三个技术方案是：
[0030]一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，具体包括以下步骤：[0031]步骤A：人成纤维细胞的提取：[0032]清理包皮组织、剪碎、洗涤，胶原酶消化后离心，弃上清，沉淀加培养基吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10％基础培养基的完全培养液进行培养，待细胞达80％融合时进行传代培养，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；[0033]步骤B：人成纤维细胞的扩增培养：[0034]取步骤A中的种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％～90％时，胰蛋白酶消化细
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胞传代培养，传代培养基采用人成纤维细胞无血清培养基；[0035]步骤C：收集人成纤维细胞无血清调节培养液：
[0036]收集P6到P15代培养过程中的人成纤维细胞调节培养上清液，即得人成纤维细胞无血清调节培养液。
[0037]本发明的第三个特点还在于，[0038]上述步骤B传代培养条件为：温度为37℃，CO2浓度为5％。[0039]本发明的有益效果是：[0040](1)利用无血清培养基替代传统含动物血清的培养基来培养人成纤维细胞，避免了动物源性成分污染以及异种蛋白引起人体免疫反应等不安全因素；[0041](2)在制备无血清培养基时，添加了组合细胞生长因子、葡多酚、黄芪多糖、透明质酸等，重组生长因子的作用是维持和刺激人成纤维细胞增殖，葡多酚是一种天然人体细胞增殖活性促进剂，对成纤维细胞表现出良好的促进和保护细胞活性的作用；黄芪多糖是一种免疫促进剂，可以减少外界环境对人成纤维细胞的损伤，保护细胞膜的完整性；透明质酸是一种重要的细胞外基质成分，可以通过与细胞表面受体结合促进细胞迁移以及胞外基质重构，能够参与成纤维细胞增殖和合成。几种物质的有效组合能够使得无血清培养基和含血清培养基在培养人成纤维细胞时表现出良好的无异性。[0042](3)本发明得到的人成纤维细胞调节培养液为无血清培养液，不仅安全上有保证，而且美容护肤功效非常显著，主要表现为抗衰方面的功效。附图说明
[0043]图1为本发明实施例1～3制备的的人成纤维细胞无血清培养基作用于人成纤维细胞的增殖情况；
[0044]图2(a)是P8代人成纤维细胞在本发明实施例一的人成纤维细胞无血清培养基的生长情况；
[0045]图2(b)是P8代人成纤维细胞在本发明实施例二的人成纤维细胞无血清培养基的生长情况；
[0046]图2(c)是P8代人成纤维细胞在本发明实施例三的人成纤维细胞无血清培养基的生长情况；
[0047]图2(d)是P8代人成纤维细胞在在含10％胎牛血清培养基中的生长情况；
[0048]图3是利用本发明人成纤维细胞无血清培养基作用于人成纤维细胞后获得的人成纤维细胞调节培养液及胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子、重组人胶原蛋白单一生长因子对BALB/c 3T3细胞增殖情况；
[0049]图4是使用与未使用本发明人成纤维细胞调节培养液的面部区域平均粗糙度Rz值的对比图；
[0050]图5是使用与未使用人成纤维细胞调节培养液的面部区域算术平均粗糙度Ra值的对比图；
[0051]图6使用与未使用本发明人成纤维细胞调节培养液的面部区域皮肤弹性参数值的对比图。
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具体实施方式
[0052]下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。[0053]一种人成纤维细胞无血清培养基，包括体积百分比为90～98％的基础培养基和体积百分比为2～10％无血清培养上清浓缩液；还包括如下组分及其浓度：维生素组合物5～100ng/mL，葡多酚(GPC)50～200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)1～50ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)50～200ng/mL，重组人转化生长因子β1(rh-TGF-β1)1～50ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)1～10ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)1～10ng/mL，β-巯基乙醇50～200μM，人血白蛋白1～100μg/mL，谷胱甘肽1～100μg/mL，黄芪多糖1～50μg/mL，透明质酸0.1～5μg/mL，碳酸氢钠1.0～3.7g/L。[0054]基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基。[0055]维生素组合物是维生素B、维生素C的一种或两种任意比例组合物。维生素为细胞的生长代谢提供必要的维生素，能够促进细胞生长、延长细胞活性，降低代谢产物堆积。[0056]葡多酚指主要成分是不同数量的儿茶素和表儿茶素单体以不同的空间结构聚合成的原花青素。葡多酚对人脐带间充质干细胞、人体血管内皮细胞、成纤维细胞等都表现出促进和保护细胞活性，是一种天然人体细胞增殖活性促进剂。[0057]人表皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、人转化生长因子β1、血小板衍生生长因子-C、人胰岛素样生长因子-1几种细胞生长因子协同作用，能够启动DNA、蛋白质和脂肪酸的合成，加速成纤维细胞由G0-G1，G1-S期的转换，缩短细胞群体倍增时间，促进细胞分裂与增殖。
[0058]谷胱甘肽在维持成纤维细胞的氧化还原环境起至关重要的作用，主要通过谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)这两种酶来清除细胞内的自由基和过氧化物。[0059]β-巯基乙醇在培养基中作为抗氧化剂，使谷胱甘肽维持在还原状态，有效提高细胞内还原性谷胱甘肽的含量，从而通过还原性谷胱甘肽抵御过氧化氢对细胞的损伤。[0060]人血白蛋白是重要的血清替代成分，可作为稳定剂和保护剂促进成纤维细胞生长。
[0061]黄芪多糖是一种免疫促进剂，可以减少外界环境对人成纤维细胞的损伤，保护细胞膜的完整性。
[0062]透明质酸是一种重要的细胞外基质成分，可以通过与细胞表面受体结合促进细胞迁移以及胞外基质重构，能够参与成纤维细胞增殖和合成。[0063]一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，包括以下具体步骤：[0064]步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
[0065]人成纤维细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80～90％时，收集人成纤维细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液；[0066]步骤2：制备生长因子浓配液
[0067]将重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β1、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1五款生长因子配制成50ug/mL的浓配液A，在无菌条件下，冻存；[0068]步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基
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将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、黄芪多糖、透明质酸钠溶解于
基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液B；[0070]将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的冻存的浓配液A加入混合液B中混合均匀，得人成纤维细胞无血清培养基。
[0071]步骤1中人成纤维细胞以5×103～8×103/cm2接种于无血清培养基。[0072]步骤1中过滤采用0.45μm微滤膜。
[0073]步骤1中采用截留分子量为3KDa的超滤系统进行切向流超滤浓缩。[0074]步骤1中超滤浓缩至过滤后人成纤维细胞上清液体积的1/15～1/20。[0075]步骤1中超滤浓缩后补充超纯水至总蛋白浓度为10mg/mL。[0076]一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，采用一种人成纤维细胞无血清培养基获取，具体包括以下步骤：[0077]步骤A：人成纤维细胞的提取：
[0078]取手术后青少年(5-10岁)包皮组织，清理剪碎，PBS洗涤，胶原酶消化后离心，弃上清，沉淀加培养基吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10％胎牛血清(FBS)的完全培养液，放置于培养箱中培养。待细胞达80％融合时进行传代，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；[0079]步骤B：人成纤维细胞的扩增培养：[0080]取种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80％-90％时，将胰蛋白酶消化细胞，采用人成纤维细胞无血清培养基进行传代培养，传代培养条件为：37℃，5％CO2；[0081]步骤C：收集人成纤维细胞无血清调节培养液：
[0082]收集传代(P6到P15代)培养过程中的人成纤维细胞调节培养上清液，即得人成纤维细胞无血清调节培养液。
[0083]采用包皮为捐献者捐献所得，捐献者需要进行适合性检查，其中包括：一般查体、常规检查、ALT、TP、HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、HTLV的检验。以上各项指标合格后，方可作为来源包皮，同时捐献者需要签署知情同意书。
[0084]本发明的人成纤维细胞无血清调节培养液不含动物血清，可添加到一些美容、护肤及生发育发产品中，主要用于皮肤皱纹、色斑、瘢痕的修复治疗以及毛发的修复生长治疗。
[0085]实施例1[0086]制备一种人成纤维细胞无血清培养基，其方法如下：[0087]步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
[0088]人成纤维细胞以5×103/cm2接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80％时收集培养上清液，得体积为6.5L的上清液，将6.5L的上清液经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径为0.45μm，将此微滤液采用截留分子量为3KDa的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜的单块膜包面积为0.1m2，共计4块膜包；采用切向流工艺进行浓缩，透过端液体废弃处理，微滤液浓缩至原微滤液体积的1/15时停止浓缩，打空超滤系统中液体，得浓缩液425mL，BCA蛋白试剂盒检测浓缩液蛋白含量为10.9mg/mL，向浓缩液中补充38mL超纯水，最终形成蛋白含量为10mg/mL的无血清培养上清浓缩液463mL，分装至50mL无菌离心管中-80℃冻存。
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步骤2：制备生长因子浓配液
[0090]将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)、重组人转化生长因子ββ重组人1(TGF-1)、胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/mL，配制成浓配液A，然后分装于1.5mL无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融。
[0091]步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基[0092]将40μg维生素B，30μg维生素C、60mg原花青素、4.5mgβ-巯基乙醇，53mg人血白蛋白，55mg谷胱甘肽，2mg黄芪多糖，3mg透明质酸钠溶解于1L DMEM基础培养基中，搅拌混合均匀后加入3.7g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，得到混合液B。
[0093]将步骤1的无血清培养上清浓缩液60mL和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)105μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)1100μl、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)200μl、重组人转化生长因子ββμl、重组人胰1(rh-TGF-1)105岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)120μl)配制的浓配液A，加入到混合液B中混合均匀即得人成纤维细胞无血清培养基。
[0094]本实施例得到的人成纤维细胞无血清培养基，总体积为1060mL，其中，基础培养基94.3％(v/v)，无血清培养上清浓缩液5.7％(v/v)，维生素组合物浓度66ng/mL，葡多酚浓度56.7μg/mL，rh-EGF浓度5.0ng/mL，rh-bFGF浓度52.0ng/mL，rh-PDGF-C浓度9.4ng/mL，rh-TGF-βrh-IGF-1浓度5.7ng/mL，β-巯基乙醇浓度54.4μM，人血白蛋白浓度1浓度5.0ng/mL，50ug/mL，谷胱甘肽浓度51.9μg/mL，黄芪多糖浓度1.9μg/mL，透明质酸浓度2.8μg/mL，碳酸氢钠浓度3.5g/L。[0095]实施例2[0096]制备一种人成纤维细胞无血清培养基，其方法如下：[0097]步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
[0098]人成纤维细胞以6×103/cm2接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为85％时收集培养上清液，得体积为20L的上清液，将20L的上清液经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径为0.45μm。将此微滤液采用截留分子量为3KDa的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜的单块膜包面积为0.1m2，共计6块膜包，采用切向流工艺进行浓缩，透过端液体废弃处理，微滤液浓缩至原微滤液体积的1/17时停止浓缩，打空超滤系统中液体，得浓缩液1170mL，BCA蛋白试剂盒检测浓缩液蛋白含量为11.9mg/mL，向浓缩液中注射用水222mL，最终形成蛋白含量为10mg/mL的无血清培养上清浓缩液1392mL，分装至500mL无菌瓶、50mL无菌离心管中-80℃冻存。[0099]步骤2：制备生长因子浓配液
[0100]将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)、重组人转化生长因子ββ重组1(rh-TGF-1)、人胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/mL，配制成浓配液A，然后分装于1.5mL无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融。
[0101]步骤(3)：制备人成纤维细胞无血清培养基
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CN 110551683 A[0102]
说 明 书
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将8μg维生素C，200mg原花青素，15mgβ-巯基乙醇，1.22mg人血白蛋白，100mg谷胱
甘肽，25.5mg黄芪多糖，5.1mg透明质酸钠溶解于1L DMEM/F12中，搅拌混合均匀后加入1.2g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，得到混合液B。
[0103]将步骤1的无血清培养上清浓缩液20mL和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)980μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)2040μl、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)92μl、重组人转化生长因子β1(rh-TGF-β1)510μl、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)49μl)配制的浓配液A，加入到B液中混合均匀即得人成纤维细胞无血清培养基。
[0104]本实施例得到的人成纤维细胞无血清培养基，总体积为1020mL，其中，基础培养基98.0％(v/v)，无血清培养上清浓缩液2.0％(v/v)，维生素组合物浓度7.8ng/mL，葡多酚浓度196.0μg/mL，rh-EGF浓度48.0ng/mL，rh-bFGF浓度100.0ng/mL，rh-PDGF-C浓度4.5ng/mL，rh-TGF-βrh-IGF-1浓度2.4ng/mL，β-巯基乙醇浓度188.5μM，人血白蛋白浓1浓度25ng/mL，
度1.2μg/mL，谷胱甘肽浓度98.0μg/mL，黄芪多糖浓度25μg/mL，透明质酸浓度5.0μg/mL，碳酸氢钠浓度1.2g/L。[0105]实施例3[0106]制备一种人成纤维细胞无血清培养基，其方法如下：[0107]步骤1：制备无血清培养上清浓缩液
[0108]人成纤维细胞以8×103/cm2接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为90％时收集培养上清液，得体积为10L的上清液，将10L的上清液经平板滤器过滤，过滤滤膜孔径为0.45μm。将此微滤液采用截留分子量为3KDa的醋酸纤维素超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜以及超滤系统厂家为Millipore，单块膜包面积为0.1m2，共计6块膜包，采用切向流工艺进行浓缩，透过端液体废弃处理，微滤液浓缩至原微滤液体积的1/20时停止浓缩，打空超滤系统中液体，得浓缩液490mL，BCA蛋白试剂盒检测浓缩液蛋白含量为13.8mg/mL，向浓缩液中补充186mL超纯水，最终形成蛋白含量为10mg/mL的无血清培养上清浓缩液676mL，分装至500mL无菌瓶、50mL无菌离心管中-80℃冻存。[0109]步骤2：制备生长因子浓配液
[0110]将市售重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)、重组人转化生长因子β1(rh-TGF-β1)、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)分别溶解在注射用水或灭菌的超纯水中，保证各细胞生长因子浓度为50ug/mL，配制的浓配液A，然后分装于1.5mL无菌离心管中存放于-20℃，避免反复冻融。[0111]步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基[0112]将100μg维生素B，100mg原花青素，7mgβ-巯基乙醇，95mg人血白蛋白，2.5mg谷胱甘肽，54.8mg黄芪多糖，219μg透明质酸钠溶解于1L DMEM/F12基础培养基中，搅拌混合均匀后加入1.2g碳酸氢钠，然后过0.22μm滤膜，收集滤液，得到混合液B。
[0113]将步骤1的无血清培养上清浓缩液95mL和步骤2的生长因子浓配液(重组人表皮细胞生长因子(rh-EGF)548μl、重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)3.9mL、重组血小板衍生生长因子-C(rh-PDGF-C)33μl、重组人转化生长因子β1(rh-TGF-β1)1.1mL、重组人胰岛素样生长因子-1(rh-IGF-1)219μl)配制的浓配液A，加入到B液中混合均匀即得人成纤维细
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胞无血清培养基。
[0114]本实施例得到的人成纤维细胞无血清培养基，总体积为1095mL，其中，基础培养基91.3％(v/v)，无血清培养上清浓缩液8.7％(v/v)，维生素组合物浓度91.3ng/mL，葡多酚浓度91.3μg/mL，rh-EGF浓度25.0ng/mL，rh-bFGF浓度180.0ng/mL，rh-PDGF-C浓度1.5ng/mL，rh-TGF-βrh-IGF-1浓度10ng/mL，β-巯基乙醇浓度82.0μM，人血白蛋白浓度1浓度50ng/mL，
86.8μg/mL，谷胱甘肽浓度2.3μg/mL，黄芪多糖浓度50μg/mL，透明质酸浓度0.2μg/mL，碳酸氢钠浓度1.1g/L。[0115]实施例4
[0116]人成纤维细胞无血清培养基性能分析[0117](一)增殖能力
[0118]对比对照组和样品组在培养7天中，对人成纤维细胞增殖活力的影响，细胞活力是指总细胞群中活细胞所占的百分比，活细胞越多，光密度值(OD)就越高。通过酶标仪测定活细胞的数量，OD值越高表示活细胞数量越多。[0119]对照组——10％FBS的DMEM/F12培养基[0120]样品组——实施例1、实施例2、实施例3得到的人成纤维细胞无血清培养基[0121]收集对数生长期人成纤维细胞，重悬于完全培养液中，血细胞计数板计数，调整细胞浓度为3×104个/mL，100μl/孔接种于96孔板上，做6复孔，96孔板四周采用无菌PBS填充，37℃，5％CO2培养箱中培养24h；[0122]24h后吸去细胞孔上清液，每孔加入100μl维持培养液继续培养24h；[0123]24h后吸去上清液，每孔加入样品组200μl分别进行培养1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，同时以维持培养液作为对照组；
[0124]培养时间到时取出96孔板，每孔中加入5mg/mL MTT溶液20μL孵育4h后，将孔板中液体倒出，每孔加入二甲基亚砜200μL，于37℃避光振摇15min，测定各孔的光密度值(OD)，检测波长492nm，以630nm为参比波长；检测结果见图1。[0125]从检测结果可以看出，相对于对照组的含10％FBS的培养基，采用本发明的人成纤维细胞无血清培养基(实施例1、实施例2、实施例3)进行人成纤维细胞培养表现出良好的细胞增殖能力，说明本发明的人成纤维细胞无血清培养基各组分配比合理，能够提高成纤维细胞增殖活性。[0126](二)形态及生长
[0127]取P8代人成纤维细胞种子细胞进行复苏，分别采用实施例1、实施例2、实施例3中人成纤维细胞无血清培养基进行培养，对照组采用含10％FBS的DMEM/F12培养基，培养72h后，细胞贴壁生长，形态为梭形，活细胞数量均达到1×105/mL以上，显微镜下观察细胞形态见图2。图2a、图2b、图2c分别是采用实施例1、实施例2、实施例3中人成纤维细胞无血清培养基进行人成纤维细胞培养的10×10倍倒置显微镜照片，图2d为采用对照组培养基进行人成纤维细胞培养的10×10倍倒置显微镜照片。[0128]从细胞的显微镜照片可以看出，本发明的人成纤维细胞无血清培养基较含血清完全培养基在培养人成纤维细胞过程中细胞状态表现出无差异性。[0129]实施例5
[0130]人成纤维细胞调节培养液获取
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(一)组织来源
[0132]6岁需要进行包皮手术的青少年，青少年监护人签署捐赠知情同意书，青少年需要进行适合性检查，其中包括：一般查体、常规检查、ALT、TP、HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、HTLV的检验，各项指标合格后采集包皮手术后组织。[0133](二)人成纤维种子细胞获取
[0134]将新摘取的皮肤组织块去掉皮下结缔组织，剪切成细条，皮条组织采用PBS重复洗涤3次后剪碎消化。加入胶原酶消化完全后，再加入DMEM稀释，过滤，收集滤液进行离心。离心后弃上清，加入DMEM吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10％FBS的完全培养液，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。每天通过倒置显微镜观察细胞状态，待细胞达80％融合时进行传代，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存。[0135](三)人成纤维细胞调节培养液获取[0136]取P3代种子细胞进行复苏，采用实施例1中人成纤维细胞无血清培养基进行培养，收集不同代数(P6-P15)细胞产生的培养上清混合后即得人成纤维细胞调节培养液，记做FBs-001。
[0137]取P4代种子细胞进行复苏，采用实施例2中人成纤维细胞无血清培养基进行培养，收集不同代数(P6-P15)细胞产生的培养上清混合后即得人成纤维细胞调节培养液，FBs-002。
[0138]取P5代种子细胞进行复苏，采用实施例3中人成纤维细胞无血清培养基进行培养，收集不同代数(P6-P15)细胞产生的培养上清混合后即得人成纤维细胞调节培养液，FBs-003。
[0139]实施例6
[0140]人成纤维细胞调节培养液分析
[0141]对实施例5得到的人成纤维细胞调节培养液(FBs-001，FBs-002，FBs-003)进行细胞因子等含量检测。
[0142]检测方法采用质谱PRM技术，有针对的选择数据进行质谱数据的信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则的离子信号干扰，通过对数据的统计分析，从而获取质谱定量信息。通过合成同位素标记肽段，结合PRM定量分析对目标蛋白(生长因子)绝对定量。
[0143]检测的目标蛋白种类为rh-EGF，rh-bFGF，rh-PDGF-C，rh-TGF-β1，rh-IGF-1，I型胶原的αα1链和2链。
[0144]首先采用化学合成法合成目标蛋白，根据已知蛋白的序列表，选出靶蛋白的特异肽段，选择同位素标记的氨基酸，按照特异肽段的氨基酸序列脱水缩合，合成肽段，LC-MS分析合成多肽的纯度。[0145]每个样品取2μg(经浓缩-重溶-去除SDC-脱盐等处理)多肽经nano-UPLC液相系统EASY-nLC1200进行分离，并使用在线质谱仪(Q-Exactive)进行检测。分析采用100μm ID×30cm反相色谱柱。流动相A液为0.1％甲酸乙腈水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，色谱柱以100％的A液平衡。样品由自动进样器直接上样到色谱柱，再经色谱柱分离，流速300nL/min，梯度时长240min。流动相B：35％持续212min，35-45％持续20min，45–100％持续2min，100％持续2min，100–2％持续2min，2％持续2min。
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酶解产物经nano-UPLC分离后连用Q-Exactive质谱仪(ThermoFinnigan)在线进行
质谱分析。分析时长：120min/sample，正离子检测模式，母离子扫描范围：unique peptides m/z。DDA采集方式为：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2scan，HCD)。MS1在m/z 200时分辨率为70,000，MS2在m/z 200时分辨率为17,500；MS1AGC为3E+6，MS2AGC为1E+5，最大离子注入时间(Max IT)：MS1，50ms，MS2，45ms。标准化碰撞能量(NCE)为28％，隔离窗口为2m/z，动态排除时间60s。
[0147]表1人成纤维细胞调节培养液中几种细胞因子及胶原蛋白含量
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实施例7
[0150]人成纤维细胞调节培养液的生物学活性及功效评价[0151](一)人成纤维细胞调节培养液生物学活性
[0152]对本发明的人成纤维细胞调节培养液进行生物学活性评价。采用《中国药典》2015版三部生物学活性/效价测定法——MTT比色法进行。[0153]测定方法：[0154](1)将对数生长期BALB/c 3T3细胞采用0.25％胰酶进行消化，用消化终止液终止消化，离心后收集BALB/c 3T3细胞，重悬于完全培养液中，细胞计数仪计数，调整细胞浓度为0.5×105个/mL，100μl/孔接种于96孔板上，做6复孔，96孔板四周采用无菌PBS填充，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，以上操作均在无菌条件下进行；[0155](2)24h后吸去细胞孔上清液，每孔加入100μl维持培养液继续培养24h，以上操作均在无菌条件下进行；[0156](3)24h后吸去上清液，换为供试品，每孔加入200μl供试品进行培养，分别于24h、72h、120h、168h后进行检测，以上操作均在无菌条件下进行；[0157](4)分别在培养24h、72h、120h、168h后取出96孔板，倒置显微镜观察细胞状态后，向96孔板中加入20μl MTT/孔，并用锡纸包好，放入37℃培养箱中培养4h。时间到后，去除每孔中的培养液，在每孔中加入150μlDMSO，微量振荡器震荡10min，直至蓝紫色结晶完全溶解。放入酶标仪进行测试，检测波长为570nm，以630nm为参比波长，记录测定结果。[0158]测试样品及对比组设置见下表：[0159]表2测试样品情况
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[0160]
检测结果：
[0162]试验过程中通过倒置显微镜观察在培养周期内BALB/c 3T3细胞生长状况良好，且人成纤维细胞调节培养液作用于BALB/c 3T3细胞较单个因子及重组人胶原蛋白作用于BALB/c 3T3细胞，其细胞生长状态更好，增殖旺盛，折光度强，胞质内无颗粒物。[0163]从图3可以看出在培养24h时，五者之间对BALB/c 3T3细胞增殖作用并不明显；但随着培养时间的增长，在培养72h、120h时，人成纤维细胞调节培养液对BALB/c 3T3细胞增殖作用明显优于单一因子及胶原蛋白对BALB/c 3T3细胞增殖作用；在培养168h时较培养120h，五者对BALB/c 3T3细胞增殖作用均有所降低，但人成纤维细胞调节培养液比单个因子及胶原蛋白下降的缓慢。
[0164]由此说明人成纤维细胞调节培养液较单一因子或胶原蛋白能更有力的促进细胞增殖，并且可延缓细胞凋亡。[0165](二)人成纤维细胞调节培养液功效评价
[0166]对本发明的人成纤维细胞调节培养液进行人体功效评价。选择48位皮肤无敏感史，年龄在30～55周岁的女性，随机以志愿者半边面部为产品区域，另半边面部为对照区域，志愿者在规定的时间里每天涂抹两次人成纤维细胞调节培养液于面部，并结合基础的皮肤护理。分别于0周、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周后测量受试区和对照区的皮肤纹理度值及皮肤弹性，并对志愿者进行自我评价问卷。[0167]区域设计：
[0168]A区(产品区域)：除基础皮肤护理外涂抹人成纤维细胞调节培养液[0169]B区(对照区域)：除基础皮肤护理外不涂抹人成纤维细胞调节培养液[0170]皮肤整体数值分布采用均值分析，不同部位之间本底值的比较采用t检验分析。[0171]计算测试区域初始值与其他时间点测定值之间的差值，然后利用此差值，统计分析不同时间点产品区和空白对照区的差别。[0172]相对未使用样品前，即变化率(％)＝((Tn-T0)/T0)×100[0173]式中，Tn——受试区域随时间变化数值[0174]T0——受试区域起始值[0175]如测试数据为正态分布，则采用配对t检验方法进行统计分析；如测试数据非正态
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分布，则采用秩和检验方法进行统计分析。[0176]测试指标：
[0177]平均粗糙度Rz，算术平均粗糙度Ra，皮肤弹性(R2、R5、R7)[0178]测试结果：[0179]测试数据见表3，表4，表5：[0180]表3皮肤平均粗糙度Rz值表
[0181]
[0182]
表4皮肤算术平均粗糙度Ra值表
[0183]
[0184]
[0185]
表5皮肤弹性参数表
[0186]
[0187]
受试部位在使用产品的测试周期内，与初始值相比较，其皮肤平均粗糙度和算术
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平均粗糙度均有显著的降低，而对照区皮肤粗糙度变化不明显；皮肤弹性参数(R2、R5、R7)保持增长的趋势，而对照区整体变化不明显。(具体见图4，图5，图6)[0188]在测试周期内，本次测试项目共筛选48人纳入研究，组间脱落6人，故本次测试的有效志愿者人数为42人。
[0189]42名有效志愿者中有38人感觉自己的皮肤纹理有所改善，有36人感觉自己的皮肤弹性有所增加。志愿者的自我评价问卷证实了人成纤维细胞调节培养液的抗衰效果很容易被使用者观察到。在8周的研究中证实人成纤维细胞调节培养液的耐受性良好，且受试人群中未出现明显的全身不良反应或3级以上的皮肤刺激，无不良事件报告。
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图1
图2
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图3
图4
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图5
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